摘要：綜述了近幾年來國內(nèi)外蜂蜜中氯霉素殘留檢測(cè)方法。著重介紹了高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、酶聯(lián)免疫法、色/質(zhì)聯(lián)用分析法以及生物傳感器法，并分別綜述了各種方法的優(yōu)勢(shì)與不足，最后展望了蜂蜜中氯霉素殘留檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：蜂蜜；氯霉素；殘留；高效液相色譜法；毛細(xì)管電泳法；酶聯(lián)免疫法；色／質(zhì)聯(lián)用分析法；生物傳感器法

近年來，國內(nèi)外發(fā)展起來的蜂蜜中氯霉素殘留量檢測(cè)方法有液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、免疫分析法、色譜／質(zhì)譜聯(lián)用法等?，F(xiàn)對(duì)這些檢測(cè)方法作一介紹。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法HPLC是將一定極性的單一或混合溶劑作為流動(dòng)相，用泵將流動(dòng)相注入裝有填充劑的色譜柱內(nèi)，注入的供試品被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)進(jìn)行分離，各成分先后進(jìn)入檢測(cè)器，用記錄儀或數(shù)據(jù)處理裝置記錄色譜圖和進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出測(cè)定結(jié)果。

1982年 Juergens U 使用HPLC分析蜂蜜中氯霉素和磺胺噻唑殘留。1994年胡大晰等應(yīng)用HPLC定量分析出口蜂蜜中氯霉素殘留量，樣品用去離子水溶解后，經(jīng)1-X8吸附樹脂柱凈化和富集，在Waters C18柱上分離，紫外測(cè)定。檢測(cè)限為0.01 μg/g，回收率為86.37％～101.5%。

日本2002年對(duì)進(jìn)出口蜂蜜中氯霉素的檢測(cè)是先把蜂蜜中氯霉素用0asis HLB固相萃取小柱精制后，用乙酸乙酯提取，硅膠柱精制，再用HPLC和紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)限為0.10 mg/kg。2005年Moise.A等也是采用HPLC對(duì)來自羅馬尼亞不同地區(qū)的10個(gè)蜂蜜樣品中氯霉素進(jìn)行殘留分析。

HPLC雖然分離效率高，速度快，但儀器昂貴，樣品需要前處理，操作人員需要進(jìn)行嚴(yán)格的培訓(xùn)，并且最低檢測(cè)限較高，無法滿足當(dāng)前對(duì)氯霉素低殘留量的檢測(cè)要求。 2 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法也稱為高效毛細(xì)管電泳法，是近幾年來迅速發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)，是在毛細(xì)管中利用帶電組分在高電場(chǎng)中遷移率不同而進(jìn)行分離的，其顯著特點(diǎn)是高效、快速和微量。

2001年，陳天豹等用此法結(jié)合二級(jí)管陣列紫外檢測(cè)器對(duì)蜂蜜中殘留的氯霉素進(jìn)行定量分析，氯霉素的檢測(cè)限為10 μg/L，回收率大于89.6％。

此法雖然不需要復(fù)雜的抽提和凈化程序，具有簡單、柱效高、分離速度快、樣品用量少、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，但最低檢測(cè)限仍然較高，無法滿足當(dāng)前對(duì)氯霉素低殘留量的檢測(cè)要求。

3 酶聯(lián)免疫分析法

氯霉素定量酶聯(lián)免疫檢測(cè)法是利用抗體與抗原間免疫化學(xué)反應(yīng)，酶標(biāo)氯霉素結(jié)合體與樣品檢體中氯霉素殘留物同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)固定在酶標(biāo)子L的氯霉素抗體，待檢體中氯霉素的含量愈高，顯色反應(yīng)愈淺，待檢體中氯霉素的含量愈低，顯色反應(yīng)愈深。再加入終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品檢體吸光值，吸光值與樣品檢體中氯霉素濃度成反比。

2004年劉堃等采用辣根過氧化物酶與氯霉素結(jié)合作為酶標(biāo)氯霉素進(jìn)行反應(yīng)，其檢測(cè)靈敏度為0.3 μg／kg。隨著研究工作的深入發(fā)展已有測(cè)定氯霉素的試劑盒投放市場(chǎng)，但蔣宏偉等使用荷蘭生產(chǎn)的EUSA試劑盒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，氯霉素的檢測(cè)限為0.02 ng/g。

HAO Yu Shen 等采用的是由r-Biopharm公司提供的試劑盒，檢出限為0.30 μg/kg。而G.ScoKichini 等用由Euro-Diapostica B.V 提供的試劑盒進(jìn)行EUSA定性篩選，蜂蜜的檢測(cè)力小于0.30 μg/kg。

酶聯(lián)免疫法具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度較高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，適合于現(xiàn)場(chǎng)篩選。但ELISA中可發(fā)生多種非特異吸附作用，其主要的非特異反應(yīng)是由于抗體反應(yīng)體系選擇不當(dāng)所致，不合適的抗體反應(yīng)體系引起的非特異反應(yīng)可導(dǎo)致EHSA出現(xiàn)假附性結(jié)果，并且只作為陰性確認(rèn)，其結(jié)果若為附性，還需用GC／MS進(jìn)一步確認(rèn)。

4 色／質(zhì)聯(lián)用分析法

4.1 氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法

氣相色譜是一種公認(rèn)的快速、高效的分離技術(shù)，特別適合于復(fù)雜混合物的分離。由于它只是利用保留時(shí)間作為鑒定手段，要對(duì)分離出來的每個(gè)組分做出明確鑒定是困難的。而質(zhì)譜法是一種重要的定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析方法，對(duì)復(fù)雜的有機(jī)化合物具有很高的鑒別能力，是一種高靈敏度、高效的定性分析工具，它與許多用于定性分析儀器一樣，沒有分離能力，不能直接分析化合物。二者結(jié)合起來，將色譜儀作為質(zhì)譜儀的進(jìn)樣和分析系統(tǒng)，把質(zhì)譜儀作為色譜儀的檢測(cè)器，將充分發(fā)揮色譜和質(zhì)譜各自的優(yōu)點(diǎn)。

迂君、劉宜孜等都報(bào)道了先經(jīng)固相萃取后再采用GC—MS測(cè)定蜂蜜中的氯霉素殘留量，并且所選用的離子源都是化學(xué)電離源(CI)。其中迂君等所選用的是正化學(xué)電離源，其檢出限僅為20 ng/mL，而劉宜孜、王建華、陳朝方均選用的是負(fù)化學(xué)電離源(NCl)，得到的相應(yīng)檢出限分別為0.1 μg/kg，0.1 μg/kg，0.5 μg/kg。

HAo Yu Shen 等分別采用氣相色譜—質(zhì)譜—電子轟擊離子源—選擇離子監(jiān)控器(GC-MS-EI-SIM)，氣相色譜質(zhì)譜—負(fù)化學(xué)電離源—選擇離子監(jiān)控器(GCMS-NCI-SIM)對(duì)包括海洋食品、肉類、蜂蜜等10種基質(zhì)中的氯霉素進(jìn)行篩選檢測(cè)，兩種分析方法所得到的檢出限分別為1.0 μg/kg和0.1 μg/kg，添加濃度下，回收率均為75％～120％。

對(duì)于氯霉素來說，負(fù)離子的CI質(zhì)譜圖靈敏度要比其正離子的CI質(zhì)譜圖高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，所以質(zhì)譜儀選用NCI的靈敏度更高，干擾更少。本法結(jié)合了氣相色譜分離特性強(qiáng)和質(zhì)譜儀良好的定性能力，使分離、定量和定性同時(shí)進(jìn)行。但是它的局限性在于只適合于分析可以氣化的樣品。

4.2 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用

高效液相色譜(HPLC)具有高分離能力和高分析速度等優(yōu)點(diǎn)，是復(fù)雜混合物分離的主要手段。但是，由于HPLC本身在進(jìn)行定性分析時(shí)的主要依據(jù)是保留值，缺乏有用的結(jié)構(gòu)信息，因而它很難以對(duì)復(fù)雜未知混合物進(jìn)行定性分析。相反，質(zhì)譜(MS)具有很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)鑒定能力，但卻不具備分離能力，因而不能直接用于復(fù)雜混合物的鑒定。把HPLC和MS有機(jī)結(jié)合起來的聯(lián)用技術(shù)，由于結(jié)合了兩者的長處，是復(fù)雜化合物分析的有效手段。在HPLc-Ms聯(lián)用系統(tǒng)中，HPLc相當(dāng)于譜學(xué)方法的分離和進(jìn)樣裝置，Ms則相當(dāng)于色譜儀的檢測(cè)器。在此基礎(chǔ)上還發(fā)展了串聯(lián)質(zhì)譜(Ms-Ms)，該法具有快速，高靈敏度和高專一性等特點(diǎn)，不受化學(xué)噪聲的干擾。

2003年 L.verzegnassi 等用液相色譜—電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法分析了來自阿根廷、澳大利亞、古巴、中國的蜂蜜中氯霉素殘留量，檢出限和檢測(cè)力都低于0.1 μg/kg。

2004年 A.F.Forti 等先將蜂蜜溶解于水，用二氯甲烷與丙酮的混合物進(jìn)行萃取，以C18柱凈化，采用電噴霧電離負(fù)離子模式，用LC-MS／MS檢測(cè)，檢出限為0.07 μg/kg，回收率為98.7％～102.0％。

2005年 Kannan.V 等用此法對(duì)商品蜜中氯霉素殘留量進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為0.05 ng/g。Anton.K F等用高效液相色譜和質(zhì)譜檢測(cè)器相結(jié)合的方法檢測(cè)蜂蜜中氯霉素，但由于其采用了sub-2 μm particulate高效液相色譜柱，靈敏度更高，分離速度更快(4.2min)，檢測(cè)限可達(dá)到0.007 μg/kg的效果。

謝文等在蜂蜜樣品中添加同位素內(nèi)標(biāo)氯霉素-d5，經(jīng)乙酸乙酯提取，自制硅膠柱和Oasis HLB小柱凈化后用高效液相色譜—電噴霧電離質(zhì)譜檢測(cè)，檢出限為0.1 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％。

Kristin.E 等報(bào)道了用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)肉、海洋食品、蛋、蜂蜜、牛奶、血漿和尿中氯霉素殘留檢測(cè)，檢出限為0.02 μg/kg。

lshii R等報(bào)道液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析蜂蜜與王漿中的氯霉素，在液相色譜分離中采用Mightyl RP-18GP柱，以醋酸銨—乙腈為流動(dòng)相，再用水稀釋，Oasis HLB柱凈化送人質(zhì)譜檢測(cè)，氯霉素定量限為0.3 ng/g，在定量限的回收率高于92％。

陳舒舒等建立了反相高效液相色譜—離子阱質(zhì)譜法檢測(cè)蜂蜜中氯霉素殘留的方法，其前處理采用的是QuEchERS方法進(jìn)行快速提取與凈化，定性定量分析采用的是電噴霧電離法(ESl)負(fù)離子模式、多反應(yīng)離子檢測(cè)器(MRM)，該法檢出限為0.1μg/kg，添加回收率水平在78％～93％間。

可見液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用得到氯霉素檢測(cè)限一般為0.007～0.100 μg/kg，能得到很高的靈敏度，并且分離和定性定量能力強(qiáng)，值得在蜂蜜氯霉素殘留檢測(cè)中推廣應(yīng)用。

5 生物傳感器法

生物傳感器(biosensors)又稱生物電極(bioelectrodes)，是近年來才發(fā)展起來的一類應(yīng)用生物反應(yīng)的新型傳感器，它是利用生物的或有生命物質(zhì)分子的識(shí)別功能與信號(hào)轉(zhuǎn)換器相結(jié)合，將生物反應(yīng)所引起的化學(xué)、物理變化變換成電信號(hào)、光信號(hào)等。

2004年 Julie F 等就報(bào)道了用表面等離共振生物傳感器與Qnexo氯霉素試劑盒檢測(cè)家禽肉、蜂蜜、對(duì)蝦和牛奶中氯霉素與氯霉素葡糖醛酸殘留，蜂蜜樣品需先用乙酸乙酯蘋取，然后表面等離子體共振對(duì)其中氯霉素與氯霉素葡糖醛酸殘留進(jìn)行免疫化學(xué)篩選，在傳感器芯片上涂上氯霉素衍生物和抗體進(jìn)行測(cè)定，檢出限為0.02 μg/kg，檢測(cè)力為0.02 μg/kg。

與傳統(tǒng)儀器相比生物傳感器成本更低，檢測(cè)精確度高，檢測(cè)判讀時(shí)間短，但傳感器的穩(wěn)定性很難控制，在應(yīng)用中會(huì)經(jīng)常碰到傳感器輸出信號(hào)的穩(wěn)定性問題，使得構(gòu)建成的測(cè)定系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成商品，由用戶來實(shí)現(xiàn)測(cè)定十分困難。

6 結(jié)語

以上所述對(duì)氯霉素殘留檢測(cè)方法中，酶聯(lián)免疫法具有特異、靈敏、快速、儀器簡單等優(yōu)點(diǎn)，能在短短的幾個(gè)小時(shí)檢測(cè)幾十到上百個(gè)試樣，可以實(shí)現(xiàn)采樣現(xiàn)場(chǎng)的適時(shí)決速檢測(cè)，非常適合對(duì)氯霉素殘留篩選的需要。而高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法具有精確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好以及假陽性少等優(yōu)點(diǎn)，只要選擇出前處理?xiàng)l件和色譜、質(zhì)譜條件，就能得到較滿意的結(jié)果，非常適合于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行科學(xué)研究。

預(yù)計(jì)今后，氯霉素殘留檢測(cè)技術(shù)主要是在這兩個(gè)方面上發(fā)展和完善。而有了檢測(cè)結(jié)果的技術(shù)支撐，將為衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)提供強(qiáng)有力的依法行政依據(jù)，以期協(xié)助國家提高蜂產(chǎn)品質(zhì)量。

引自《蜜蜂雜志》2007（8）