摘要：Hamilton 把人工授精技術(shù)運(yùn)用于昆蟲(chóng)之后，昆蟲(chóng)的遺傳特性和社會(huì)結(jié)構(gòu)就成為了生物進(jìn)化研究中的核心內(nèi)容之一。如果能確定特定蜂群內(nèi)工蜂之間的血緣關(guān)系，就能夠更好地理解和解釋群體行為和個(gè)體行為的產(chǎn)生機(jī)制，以及社會(huì)性昆蟲(chóng)的進(jìn)化特點(diǎn)。主要介紹國(guó)內(nèi)外有關(guān)蜜蜂父系研究的最新進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：父系；人工授精；進(jìn)化；親緣關(guān)系；社會(huì)性昆蟲(chóng)

Hamilton 在1963年提出的社會(huì)性昆蟲(chóng)的親緣關(guān)系理論認(rèn)為，個(gè)體之間的社會(huì)交往應(yīng)根據(jù)它們親緣關(guān)系的不同而有所差異。當(dāng)個(gè)體生活在親緣關(guān)系非常親密的群體中時(shí)，它們應(yīng)該合作，并且組成能夠生產(chǎn)、繁殖和防御的功能性團(tuán)體。親緣關(guān)系理論提出之后，立即引起了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。Wheeler 認(rèn)為如果能夠組成功能性團(tuán)體，就可以稱之為超級(jí)生物。從親緣關(guān)系角度來(lái)講，蜜蜂群體中的個(gè)體并不完全是純系，這就有可能使群內(nèi)成員之間存在潛在的沖突。

1 鑒定父系的方法 

研究處 女蜂王與雄蜂交配數(shù)量的方法很多。最早的方法是研究者觀察蜂群巢門(mén)口處 女蜂王交配后帶交配標(biāo)志進(jìn)行計(jì)數(shù)，顯然這種方法不夠科學(xué)和準(zhǔn)確，因?yàn)樘?女蜂王交配標(biāo)志有可能在歸巢前丟失，另外觀察者也很可能漏數(shù)蜂王交配后歸巢的次數(shù)。后來(lái)有人利用蜂群內(nèi)工蜂體色來(lái)估算處 女蜂王與雄蜂交配數(shù)量以及雄蜂******的利用情況，這種方法要求工蜂體色必須存在明顯差異。Page 和 Metcal 用同功酶標(biāo)記技術(shù)研究處 女蜂王與雄蜂交配數(shù)量以及雄蜂******的使用情況。但是，絕大多數(shù)同工酶在膜翅目昆蟲(chóng)中缺乏多態(tài)性，這就大大限制了它們的用途。Sasaki 認(rèn)為這種方法因分辨力低而不能有效判斷工蜂的父系來(lái)源，便運(yùn)用DNA指紋技術(shù)分析出蜂王是高度多雄******配昆蟲(chóng)，但采集DNA樣品的指紋很耗時(shí)間，且受個(gè)體提取的DNA數(shù)量的限制，必需的每個(gè)反應(yīng)和產(chǎn)生復(fù)合帶模型也都比較難分析，并且需要使用放射性探針，DNA指紋技術(shù)因而沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。Fondrk等應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記和同功酶標(biāo)記技術(shù)，準(zhǔn)確地測(cè)定出每只工蜂的父系來(lái)源?？勺兇?lián)重復(fù)序列(VNTR)標(biāo)記在蜜蜂親緣關(guān)系鑒定上的應(yīng)用也非常廣泛，VNTR多位于基因非編碼區(qū)以及染色體的近端粒區(qū)。Estoup 成功利用微衛(wèi)星技術(shù)精確標(biāo)記工蜂父系來(lái)源，蘇松坤也運(yùn)用王漿主蛋白標(biāo)記出群內(nèi)亞家庭數(shù)。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(random amplifled polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱RAPD)，是利用一系列堿基順序隨機(jī)排列的寡核苷酸單鏈(通常為十聚體)為引物，對(duì)靶核昔酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到不同條帶的電泳圖譜，再利用聚類的方法分析個(gè)體多態(tài)性。Fondrk和顏偉玉分別用20對(duì)和14對(duì)引物鑒別出意大利蜜蜂和中華蜜蜂群內(nèi)的父系數(shù)目。這種方法比較簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，避免了放射性探針的使用，而且不需要預(yù)先了解堿基序列，標(biāo)記可覆蓋整個(gè)基因組。但是RAPD標(biāo)記重復(fù)性較差，PCR擴(kuò)增條件稍有變化，擴(kuò)增結(jié)果就會(huì)改變，而且它是顯隱性遺傳，無(wú)法判斷是雜合子還是隱性純合子。

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA，簡(jiǎn)稱MS)，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列，以2-6hP為核心重復(fù)序列。利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)特異序列設(shè)計(jì)引物，不同個(gè)體核心序列因重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生多態(tài)性。MS穩(wěn)定性好，呈共顯性遺傳，且多態(tài)性含量豐富，但是必須了解微衛(wèi)星側(cè)翼序列才能設(shè)計(jì)引物。Estoup 用10對(duì)微衛(wèi)星引物A76，A107，A14，A7，A28，A29，A35，A43，A79，B124精確測(cè)定出意大利蜜蜂亞家庭數(shù)目。謝憲兵也用3對(duì)高度多態(tài)引物A14，A107，B124測(cè)定出中華蜜蜂亞家庭數(shù)目。目前在意大利蜜蜂中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)2000個(gè)微衛(wèi)星，平均遺傳距離為2.1 cm，最大間隔也不超過(guò)10 cm。

小衛(wèi)星DNA(minisatellite DNA)，以15-76bP為核心重復(fù)序列。選擇在特異序列上沒(méi)有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切成不同長(zhǎng)度的片段，然后再進(jìn)行 Southem 雜交，由于不同個(gè)體串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)目和位置不同，能形成特異的雜交譜帶，人們稱為DNA指紋圖譜(DNA fingerprinting, DFP)。DFP多態(tài)性高，個(gè)體特異性強(qiáng)，但成本太高，而且譜帶有時(shí)過(guò)于復(fù)雜。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism SNP)，是指染色體某個(gè)位點(diǎn)存在單個(gè)堿基的變化，包括堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失。SNP密度高，平均遺傳距離為2～3 cm，特別是位于表達(dá)序列內(nèi)的SNP(coding region SNP，cSNP)，可能直接影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和表達(dá)。DNA芯片已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了SNP分析的高通量和自動(dòng)化。SNP被認(rèn)為是繼RFLP和微衛(wèi)星標(biāo)記之后的第三代分子標(biāo)記，目前SNP在人類親子鑒定方面的應(yīng)用已經(jīng)十分成熟，美國(guó)伊利諾伊大學(xué)也公布了大量用于蜜蜂血緣鑒定的SNP。

基因芯片(DNA chip)，又稱DNA微列陣(DNA micro array)，它將許多特定的寡核昔酸片段或基因片段作為探針排列在硅片或玻璃晶片上，通過(guò)雜交的方式獲得信息。基因芯片首先在遺傳作圖、疾病分析、多態(tài)性分析和尋找新基因中得到了廣泛應(yīng)用，更重要的是基因芯片能確定基因的表達(dá)程度。Gene.Robinson 成功利用基因芯片對(duì)工蜂頭部基因表達(dá)的量證明了環(huán)境對(duì)基因表達(dá)的反作用。

蜂群是由許多亞家庭組成的，并且群內(nèi)存在異質(zhì)型的基因型。亞家庭內(nèi)工蜂親緣關(guān)系r＝0.75，亞家庭間工蜂的親緣關(guān)系r＝0.25。不同亞家庭對(duì)工作有不同的偏愛(ài)，不同年齡的個(gè)體發(fā)育行為也不同。正確認(rèn)識(shí)基因型結(jié)構(gòu)如何影響群體的社會(huì)性行為可以幫助我們更好地理解蜂群社會(huì)組織的進(jìn)化模式。這些檢測(cè)手段對(duì)于評(píng)估和檢驗(yàn)現(xiàn)在的親屬優(yōu)惠假說(shuō)和社會(huì)性昆蟲(chóng)的進(jìn)化是非常重要的。由于雄蜂是單倍體，基因組DNA完全來(lái)源于蜂王，可以用IBD(identical by descent)的方法推出蜂王的基因型，以更好地確定父系。值得注意的是雄蜂能在各個(gè)群內(nèi)自由進(jìn)出，為了避免誤差，最好用封蓋雄蜂幼蟲(chóng)或蛹作為樣本。

2 統(tǒng)計(jì)父系的方法

蜂王通常與多只雄蜂交配，她的后代會(huì)出現(xiàn)基因分離。蜂群由許多基因型不同的亞家庭組成，每個(gè)亞家庭的工蜂都來(lái)源于單獨(dú)的雄蜂，這可以用分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，但是，由于取樣的限制，不一定能取到所有的亞家庭成員，因此需要借助統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出遺傳關(guān)系，父系來(lái)源和父系傾向。

Starr 和 Pamilo 最早在統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上提出的計(jì)算有效父系頻率的方法在研究社會(huì)性昆蟲(chóng)基因結(jié)構(gòu)方面應(yīng)用非常廣泛。Tapy 和 Nielsen 在2002證明用這種方法計(jì)算出的父系會(huì)高于實(shí)際值，特別是在高父系頻率和低樣本的情況下，計(jì)算出的父系數(shù)目變化會(huì)很大。因此，Nielsen 在2003年提出了新的計(jì)算方法：

注：k：父系固定值；n：工蜂樣本量；pi是第i個(gè)父親的父系比率；ko是在樣本里測(cè)出的不同父系數(shù)目；v[k]：父系變化值。

最后計(jì)算出的父系＝k±v[k]。這種統(tǒng)計(jì)方法在工蜂樣本量上，特別是在低樣本情況下的偏差非常小，比較適合在小樣本條件下計(jì)算父系數(shù)目。

3 小結(jié)

在蜂群中，絕大多數(shù)工蜂都可以產(chǎn)發(fā)育成雄蜂的單倍體未受精卵。在單雄******配情況下，相對(duì)于蜂王的雄性后代而言，工蜂與它們自己雄性后代的關(guān)系更加親密。但在多雄******配情況下，工蜂與蜂王雄性后代關(guān)系更加親密。在多雄性社會(huì)性昆蟲(chóng)群體中對(duì)蜂王所產(chǎn)雄性后代的趨向性和與之更加親密的關(guān)系促使了“工蜂監(jiān)督”假設(shè)的形成(Ratnieks 1988)，在高強(qiáng)度的多雄******配條件下，工蜂應(yīng)該毀掉其它工蜂產(chǎn)的卵或者是對(duì)產(chǎn)卵工蜂表現(xiàn)出強(qiáng)烈的攻擊性(Foster＆Ratnieks 2001)。

大量關(guān)于蜂群中雄性母系來(lái)源的數(shù)據(jù)與工蜂監(jiān)督理論都是一致的(Ratnieks＆Visscher 1989；Foster＆Ratnieks2001a；Foster2000；Halling2001；Oldroyd 2001)，蜂王是絕大多數(shù)雄性后代的母親。但是，與工蜂監(jiān)督理論相反，在單雄性蜂群中，雖然工蜂與自己雄性后代的親緣關(guān)系更近，但群內(nèi)雄蜂的繁殖還是由蜂王控制(Ar 6 valo 1998；Walin 1998；Foster 2001；Paxton 2001)。

用分子標(biāo)記分析父系來(lái)源能更好地理解更大范圍內(nèi)的問(wèn)題。在過(guò)去的幾年中，國(guó)內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開(kāi)始用DNA指紋技術(shù)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)，希望能夠找到更多的可用標(biāo)記，DNA指紋技術(shù)已經(jīng)證明了它在人類醫(yī)學(xué)上的重要作用，但在群體學(xué)上的研究卻不是那么成功。著力于開(kāi)發(fā)SNP和EST的實(shí)驗(yàn)室也很多，用以制備更加精密的遺傳圖譜和物理圖譜。1998年9月，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)情報(bào)中心NCBI在人類原有基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，增設(shè)了SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，包括各種族發(fā)現(xiàn)的基因組和cSNP檔案性數(shù)據(jù)庫(kù)。美國(guó)國(guó)家信息中心 CenBank、歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室EMBL、日本國(guó)家數(shù)據(jù)庫(kù)DDB也都可以通過(guò)基因名稱、染色體號(hào)、SNP檢索號(hào)等方法來(lái)提取SNP信息。

參考文獻(xiàn)（略）

引自《蜜蜂雜志》2007（10）

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所 黃強(qiáng) 曾志將