蜜蜂是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲。同時，蜜蜂也是研究真社會昆蟲個體特征分化最典型的模式體系，蜜蜂已成為系統(tǒng)論、行為生態(tài)學(xué)、神經(jīng)學(xué)和老年化研究的模型。蜜蜂具有世代周期短、繁殖率高、后代個體數(shù)多、能大量飼養(yǎng)、易獲得大量性狀一致、發(fā)育同步的群體等優(yōu)點(diǎn)，是理想的實(shí)驗(yàn)動物研究模型。

蜜蜂作為人類開發(fā)利用最早和最成功的少數(shù)昆蟲之一，現(xiàn)在人類對于蜜蜂的遺傳學(xué)、生理生化等的研究非常充分。蜜蜂種質(zhì)資源十分豐富，蜜蜂基因組測序計(jì)劃已完成，蜜蜂轉(zhuǎn)基因研究具備非常有利的條件。如果人類能研究發(fā)展出一種較為完善的轉(zhuǎn)基因蜜蜂技術(shù)體系，不僅為我們進(jìn)一步認(rèn)識蜜蜂提供幫助，而且可在此基礎(chǔ)上建立起蜜蜂實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，將對蜜蜂的分子生物學(xué)研究起重大推動作用；還可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良蜜蜂品種以提高蜂產(chǎn)品生產(chǎn)效益、增強(qiáng)農(nóng)作物授粉，或者研制蜜蜂生物反應(yīng)器，生產(chǎn)生物活性物質(zhì)。通過制造轉(zhuǎn)基因蜜蜂能夠檢測內(nèi)在基因功能，有助于充分理解蜜蜂認(rèn)知、記憶等功能的分子基礎(chǔ)，對于理解基因與行為之間的關(guān)系非常重要。因此轉(zhuǎn)基因蜜蜂的研究具有重大的理論意義與經(jīng)濟(jì)效益。

轉(zhuǎn)基因蜜蜂的研究是指用實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入的方法將外源基因在蜜蜂染色體基因內(nèi)穩(wěn)定整合并能穩(wěn)定表達(dá)，其實(shí)質(zhì)是定向改造蜜蜂的遺傳組成。蜜蜂作為一種真核生物，其基因組結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性給基因工程帶來了極大的困難，尚需通過大量研究找到一種對蜜蜂轉(zhuǎn)基因的有效模式，從而使外源基因能有效地轉(zhuǎn)入、整合并獲得高效表達(dá)的新品種。國內(nèi)外科研人員在轉(zhuǎn)基因蜜蜂的研究上進(jìn)行了許多嘗試，并開發(fā)出多種蜜蜂DNA導(dǎo)入方法。如精 子載體法、脂質(zhì)體法、顯微注射法、電穿孔法等，其中，電穿孔是一種方便、迅速、高效率的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，本文對電穿孔法進(jìn)行蜜蜂外源DNA轉(zhuǎn)移作一下綜述性介紹。

1 電穿孔法原理與特點(diǎn)

電穿孔的原理就是利用高壓脈動作用將外源基因?qū)刖?子、受精卵、胚胎或胚胎干細(xì)胞內(nèi)，在極短暫的時間讓細(xì)胞暴露在高電場下，使得細(xì)胞的細(xì)胞膜產(chǎn)生相當(dāng)微小的孔洞，結(jié)果病毒顆粒、DNA等正常情況下不能通過細(xì)腦膜的物質(zhì)使得以進(jìn)出細(xì)胞，使外源DNA融合至宿主染色體中，因而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。

電穿孔基因轉(zhuǎn)染法相對其他轉(zhuǎn)基因方法，有幾個特點(diǎn)：首先在外源基因電穿孔導(dǎo)入靶器官的選擇方面，理論上動物任何組織和器官都可作為電穿的研究對象。其次，電穿孔法對導(dǎo)入外源基因片段的大小沒有限制，從幾比或十幾kb的表達(dá)載體，到100～200 kb的YAC、BAC基因組，都有成功導(dǎo)入并獲得表達(dá)的報(bào)道間。此外活體電穿孔法操作簡易，基因轉(zhuǎn)染過程在幾秒鐘內(nèi)就完成，而且DNA片段不需要特殊的純化操作，轉(zhuǎn)移效率通常比較高；對于不同細(xì)胞組織器官、不同表達(dá)基因載體，外源基因表達(dá)的時間存在巨大差異。

2 蜜蜂活體電穿孔法導(dǎo)入DNA的試驗(yàn)研究

近年來，活體電穿孔法用于動物轉(zhuǎn)基因研究報(bào)道不斷增多，成為基因治療、生物學(xué)分析等領(lǐng)域非常受歡迎的一種技術(shù)。不過，電穿孔研究報(bào)道的昆蟲種類不是很多：果蠅胚胎、谷實(shí)夜蛾胚胎以及家蠶等。家蠶電穿孔研究報(bào)告稍多，Moto 等利用電穿孔方法成功地將家蠶絲素啟動子驅(qū)動的GFP質(zhì)粒導(dǎo)入家蠶幼蟲腦細(xì)胞，經(jīng)熒光顯微鏡檢測，GFP得到組織特異性表達(dá)。趙昀等在將帶有GFP基因的質(zhì)粒導(dǎo)入家蠶卵時也嘗試采用電穿孔法，蠶卵孵化結(jié)繭后，經(jīng)檢測約5400個繭中有73個帶有熒光“亮繭”。Thomas利用電穿孔法將gfp基因?qū)肓思倚Q的早期胚胎、晚期胚胎、卵巢以及成蟲階段。2003年，李華等用電轉(zhuǎn)移儀將胰島素基因組基因?qū)思蚁墸Y(jié)果人胰島素基因能夠在蠅蛆中表達(dá)。

日本的 Takekazu Kunieda 和 Takeo Kuboo 報(bào)道了利用活體電穿孔法將外源DNA導(dǎo)入成年工蜂頭部的研究。他們通過電擊法將綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到成年蜂頭部后，在頭部原來插陽極的位置觀察到綠色熒光，經(jīng)RT-PCR和免疫雜交分析證實(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)的外源基因獲得表達(dá)。2004～2007年，郭冬生等對意大利蜜蜂和中華蜜蜂早、晚期卵電穿孔導(dǎo)入綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA的技術(shù)、檢測方法以及導(dǎo)人參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并用所得到的優(yōu)化電穿孔參數(shù)對綠色熒光蛋白載體用于中華蜜蜂和意大利蜜蜂轉(zhuǎn)基因的研究進(jìn)行了測試；實(shí)驗(yàn)中獲得了兩組較佳電穿孔電擊參數(shù)：中華蜜蜂卵(750 v/cm，100 μs，1)、意大利蜂卵門50 v/cm，160 μs，1)；實(shí)驗(yàn)中選用優(yōu)化的兩組較佳電學(xué)參數(shù)電擊，以電穿子L儀將綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA導(dǎo)人蜜蜂早、晚期卵，觀察到在處理卵孵化的幼蟲申存在綠色熒光蛋白的表達(dá)；中華蜜蜂和意大利蜜蜂早期卵陽性表達(dá)率分別可達(dá)到0.29％～1.50％和0.31％～0.90％，晚期卵陽性表達(dá)不理想，分別只有：0.00％～0.47％(中蜂)和0.00％～0.30％(意蜂)；同時蜜蜂早、晚期卵的存活率和導(dǎo)入的綠色熒光蛋白基因陽性比率是隨蜂種、電壓及脈沖時間的不同而變化；實(shí)驗(yàn)說明了活體電穿孔導(dǎo)入法可以用于蜜蜂早期卵的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)。

參考文獻(xiàn)（略）

引自《中國蜂業(yè)》2008（5）

宜春學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境資源學(xué)院

郭冬生 宜春市林業(yè)局 黃志樣