摘 要：本文采用生物信息學(xué)的方法對蜜蜂（Apis mellifera）vha16基因的cDNA序列推測編碼蛋白（GenBank登記號為AAQ21381）進(jìn)行性質(zhì)分析和功能預(yù)測。分析表明該基因有一個(gè)ORF，起始密碼子在第59位，終止密碼子在第527位，推測編碼156個(gè)氨基酸，預(yù)測其理論相對分子量為15.97kDa，理論等電點(diǎn)pI＝6.71。TMHMM-2.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，該基因的推測編碼蛋白質(zhì)序列的第15~34位、第55~77位、第92~114位和第127~149位分別有一個(gè)跨膜區(qū)。保守結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)該推測編碼蛋白序列與目前已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域數(shù)據(jù)庫中許多物種的ATP合成酶具有相似的結(jié)構(gòu)功能域，在其第13~78位和第91~156位分別為ATP合成酶C亞基保守結(jié)構(gòu)功能域。據(jù)此可推測該基因編碼蛋白即為蜜蜂ATP合成酶16kDa蛋白脂質(zhì)C亞基。

關(guān)鍵詞：蜜蜂（Apis mellifera）；vha16基因；生物信息學(xué)；功能預(yù)測

生物信息學(xué)是當(dāng)前生物科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測是其中一項(xiàng)重要的內(nèi)容。由于蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能在很大程度上依賴其空間結(jié)構(gòu)，因而進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測對于理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要的意義[1]。目前國際上正在研究通過完整基因組的數(shù)據(jù)采集來確定蛋白質(zhì)的功能。艾森伯格工作組（洛杉磯加利福尼亞大學(xué)）根據(jù)某些物種間存在同源性蛋白質(zhì)，且這些同源性蛋白質(zhì)可以相互作用這一原理發(fā)展了一種預(yù)測蛋白質(zhì)功能的方法[2]。最近，又發(fā)展了幾種計(jì)算機(jī)識別蛋白質(zhì)功能的新方法，這些方法的原理是根據(jù)相同特征的蛋白質(zhì)之間具有功能上的關(guān)聯(lián)或直接作用[3]。一般來說，對于蛋白質(zhì)功能預(yù)測分析而言，最為重要的莫過于分析目的蛋白質(zhì)是否和具有功能信息的已知蛋白質(zhì)相似。其中主要有兩個(gè)策略：同源序列分析和功能區(qū)相關(guān)的保守序列特點(diǎn)分析。

到目前為止，已經(jīng)從多種動物的質(zhì)膜上都發(fā)現(xiàn)了運(yùn)輸質(zhì)子的液泡型ATP合成酶（vacuolar-type ATPase，V-ATPase）[4-7]。陳大福也利用EST數(shù)據(jù)庫電子克隆了蜜蜂（Apis mellifera）vha16基因的cDNA序列（另文發(fā)表）。本文將采用生物信息學(xué)的方法分析蜜蜂vha16基因的cDNA序列（GenBank登記號為AY343324）推測編碼蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)，并與其他物種的同源蛋白比較，進(jìn)行同源序列和功能區(qū)相關(guān)的保守序列特點(diǎn)分析，初步推測其功能。

1方法

1.1基本性質(zhì)分析

本研究是使用Amersham公司的RESearch-version 1.0軟件分析蜜蜂vha16 cDNA序列推測編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成、理論分子量；聯(lián)網(wǎng)到http://au.expasy.org/tools/pi_tool.html用其Compute pI/MW工具分析其等電點(diǎn)（pI）[8]。

1.2跨膜區(qū)分析

蛋白質(zhì)的跨膜螺旋特征是可通過序列分析直接得到預(yù)測，并能獲得較為理想的結(jié)果。聯(lián)網(wǎng)至“http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0”或者“http://www.ch.embnet.org/software / TMPRED _form.html”可進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)分析。

1.3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域分析

簡單模塊構(gòu)架搜索工具（Simple Modular Architecture Research Tool，SMART）是目前較為理想的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析工具[9]。該數(shù)據(jù)庫由EMBL建立，其中集成了大部分目前已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域的數(shù)據(jù)，可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域的分析。1.4不同物種間蛋白質(zhì)同源性比較

從NCBI的蛋白質(zhì)庫中下載美洲煙夜蛾（Heliothis virescens，AAC37176）、煙草天蛾（Manduca sexta，CAA46187）、紅火蟻（Solenopsis invicta，AAG17394）、 2種果蠅（Drosophila melanogaster，NP_724476；Drosophila yakuba，AAR10032）、按蚊（Anopheles gambiae，XP_311406）、伊蚊（Aedes aegypti，AAB71660）等昆蟲的ATP合成酶16kDa蛋白脂質(zhì)C亞基蛋白序列，將蜜蜂vha16基因的推測蛋白序列（AAQ21381）與之進(jìn)行多重對齊。Clustal W/X軟件（http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/clustalw-e.html或http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）是十分重要的序列多重對齊分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1基本性質(zhì)

經(jīng)RESearch-version 1.0軟件分析蜜蜂vha16 cDNA序列，發(fā)現(xiàn)僅有一個(gè)ORF，起始密碼子在第59位，終止密碼子在第527位，推測編碼蛋白含有156個(gè)氨基酸，預(yù)測其理論相對分子量為15.97 kDa，理論等電點(diǎn)pI=6.71。

2.2跨膜區(qū)

將蜜蜂vha16基因推測蛋白輸入http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)序列的第15~34位、第55~77位、第92~114位和第127~149位分別含有一個(gè)跨膜區(qū)（圖1）。

圖 1 蜜蜂vha16推測編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析結(jié)果 跨膜：transmembrane； 膜內(nèi)：inside； 膜外：outside 

2.3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域分析

輸入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)功能域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該推測編碼蛋白序列與目前已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域數(shù)據(jù)庫中許多物種的ATP合成酶具有相似的結(jié)構(gòu)功能域，在其第13~78位和第91~156位分別為ATP合成酶C亞基保守結(jié)構(gòu)功能域（圖2）。

圖 2 蜜蜂vha16 cDNA推測編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)功能域的檢索結(jié)果

ATP-synt_C：ATP合成酶C亞基；頂部數(shù)字表示推測蛋白的氨基酸序列位

2.4不同物種間蛋白質(zhì)同源性比較

通過多重對齊分析發(fā)現(xiàn)，將蜜蜂vha16基因的推測蛋白質(zhì)序列與美洲煙夜蛾、煙草天蛾、紅火蟻、2種果蠅、按蚊、伊蚊等昆蟲的ATP合成酶16kDa蛋白脂質(zhì)C亞基蛋白序列，其保守區(qū)域的一致性在85%以上，同源性都在90%以上（圖3）。

3 討論

推測未知蛋白的功能較好的方法是利用同源對比發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的保守區(qū)域。如果發(fā)現(xiàn)一個(gè)蛋白質(zhì)序列和較多不同種屬或者同一種屬的蛋白質(zhì)序列具有較高的同源性（大于30%），那么提示待分析的蛋白質(zhì)序列可能是相應(yīng)家族的成員[10]。所以，根據(jù)蛋白質(zhì)同源性和保守結(jié)構(gòu)功能域分析的結(jié)果，可以初步推測蜜蜂vha16基因的推測編碼蛋白與其他物種的ATP合成酶在功能上應(yīng)該存在著確實(shí)的相關(guān)性，屬于同一個(gè)蛋白質(zhì)家族，據(jù)此可推測該基因編碼蛋白即為蜜蜂ATP合成酶16kDa蛋白脂質(zhì)C亞基。

參考文獻(xiàn)

[1]來魯華. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測與分子設(shè)計(jì). 北京: 北京大學(xué)出版社, 1993

[2]Spengler S J. Bioinformatics in the information age. Science, 2000, 287(5456): 1221-1223

[3]劉秀艷, 滕勝. 應(yīng)用計(jì)算機(jī)識別蛋白質(zhì)功能. 生命的化學(xué), 2000, 20(3): 100-102

[4]Finbow M E, Goodwin S F, Meagher L, et al. Evidence that the 16 kDa proteolipid (subunit c) of the vacuolar H+-ATPase and ductin from gap junctions are the same polypeptide in Drosophila and Manduca: molecular cloning of the Vha16k gene from Drosophila. Journal of Cell Science, 1994, 107: 1817-1824

[5]Azuma M, Ohta Y. Changes in H+-translocating vacuolar-type ATPase in the anterior silk gland cell of Bombyx mori during metamorphosis. The Journal of Experimental Biology, 1998, 201: 479-486

[6]Wieczorek H, Gruber G, Harvey W R, et al. The plasma membrane H+-V-ATPase from tobacco hornworm midgut. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 1999, 31: 67-74

[7]Vitavska O, Wieczorek H, Merzendorfer H. A novel role for subunit C in mediating binding of the H+-V-ATPase to the actin cytoskeleton. The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278: 18499-18505

[8]Bjellqvist B, Basse B, Olsen E, Celis J E. Reference points for comparisons of two-dimensional maps of proteins from different human cell types defined in a pH scale where isoelectric points correlate with polypeptide compositions. Electrophoresis, 1994, 15: 529-539

[9]Schultz J, Milpetz F, Bork P, Ponting C P. SMART, a simple modular architecture research tool: Identification of signalling domains. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: 5857-5864

[10]張成崗, 賀福初. 生物信息學(xué)方法與實(shí)踐. 北京: 科學(xué)出版社, 2002, 93

熊翠玲 陳大福 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院