摘要：從結(jié)構(gòu)、藥理作用、基因工程及分子生物學(xué)機(jī)制等方面總結(jié)7國(guó)內(nèi)外對(duì)蜂毒肽的研究概況，以期為相關(guān)研究提供有益參考。

關(guān)鍵詞：蜂毒膚；結(jié)構(gòu)；藥理作用；基因工程；分子生物學(xué)機(jī)制

蜂毒是工蜂毒腺分泌出來(lái)的一種具有芳香氣味的成分復(fù)雜的混合物，主要含有蛋白質(zhì)多肽類、酶類、生物胺類和其他物質(zhì)。蜂毒中研究較多的是蜂毒溶血肽，又稱蜂毒肽(melittin)。蜂毒肽占蜂毒干重的50％，是蜂毒中主要功能物質(zhì)。蜂毒肽可以抗菌、抗病毒、消炎、抗輻射，近年來(lái)又有對(duì)其抗癌作用進(jìn)行研究的報(bào)道。但是其臨床應(yīng)用卻有很多局限，主要原因是現(xiàn)有技術(shù)難以將蜂毒中有致敏反應(yīng)并與蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除?；蚬こ痰某霈F(xiàn)不失為一條有效途徑?，F(xiàn)將近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展作以下綜述，以期為今后的研究提供參考。

1 蜂毒肽的結(jié)構(gòu)

蜂毒肽是由26個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子量2840，其一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基順序?yàn)镹H2-GLY-ILE-GLY-ALA-VAL-LEU-LYS-VAL-LEU-THR-THR-GLY-LEU-PRO- ALA-LEU-ILE-SER-TRP-ILE-LYS-ARG-LYS-ARG-GLN-GLN-COOH。

在通常情況下，C-末端有4個(gè)氨基酸殘基攜帶正電荷，N-末端有2個(gè)氨基酸殘基攜帶正電荷，整個(gè)分子帶6個(gè)正電荷。蜂毒肽的N-末端起前20個(gè)氨基酸殘基主要是疏水的，C-末端的6個(gè)氨基酸殘基主要是親水的。分子的3個(gè)賴氨酸和2個(gè)精氨酸殘基使其成為強(qiáng)堿性肽。在個(gè)性水溶液中，蜂毒肽作為單體是以隨機(jī)的卷曲結(jié)構(gòu)存在的，而隨著pH值以及離子強(qiáng)度的增高，蜂毒肽自我交聯(lián)，形成螺旋的四聚體結(jié)構(gòu)。最近有研究發(fā)現(xiàn)在不同的溶液中蜂毒肽的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域及螺旋間的角度是不同的。螺旋結(jié)構(gòu)中前21個(gè)氨基酸是極性的，位于螺旋的表面，而非極性氨基酸在螺旋的另一面。這個(gè)兩親性(amphiphilie)是膜結(jié)合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征。所以這個(gè)特性決定蜂毒肽既可以溶于水中，又可以與膜自然結(jié)合，進(jìn)而溶解細(xì)胞。

2 蜂毒肽的藥理作用

蜂毒肽是迄今為止人類所知的抗炎活性最強(qiáng)的物質(zhì)之一，其抗炎活性是氫化可的松的100倍，可以抑制20多種革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，尤其是蜂毒肽可以抗對(duì)青霉素具有耐藥性的金黃色葡萄球菌。蜂毒肽還能增強(qiáng)磺胺類和青霉素類藥物的抗菌效力，對(duì)多種真菌、病毒也具有毒性。它具有類激素樣的作用，但無(wú)激素的不良反應(yīng)。蜂毒肽的鎮(zhèn)痛作用也十分顯著，其對(duì)前列腺素合成酶的抑制作用是吲哚鎂辛的70倍，鎮(zhèn)痛強(qiáng)度為嗎啡的40％，鎮(zhèn)痛持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)研究證明，全蜂毒、蜂毒肽、神經(jīng)毒多肽、MCD均能刺激垂體腎上腺系統(tǒng)使皮質(zhì)激素釋放增加而產(chǎn)生抗炎作用。蜂毒肽還能抑制白細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而抑制了局部的炎癥反應(yīng)。

蜂毒肽可以作用于神經(jīng)系統(tǒng)，其對(duì)N-膽堿受體有選擇性阻滯作用，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮傳導(dǎo)阻滯，并表現(xiàn)出中樞性煙堿型膽堿受體阻滯作用；蜂毒肽還能抑制周圍神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)。

用蜂毒肽代替蜂毒全毒不僅對(duì)輻射有預(yù)防作用，而且還有治療作用。高純度的蜂毒肽可以明顯提高抗輻射效應(yīng)，而且和全蜂毒比較差別非常明顯。蜂毒肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用也引起了人們的注意。蜂毒肽具有膜活性，直接對(duì)細(xì)胞的磷脂膜起溶解作用，抑制細(xì)胞發(fā)育，對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒素作用。蜂毒肽分子量小，免疫原性低，不易產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)；因其是破壞細(xì)胞膜而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，因此它不用進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞外即可顯示出其破壞腫瘤細(xì)胞毒性。澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織(CSIRo)DE Riven博士領(lǐng)導(dǎo)的分子生物學(xué)研究小組正在對(duì)蜂毒肽的抗癌作用進(jìn)行研究，他們制造的以蜂毒肽為“彈頭”的抗毒素也可對(duì)前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌產(chǎn)生療效。《中國(guó)醫(yī)藥報(bào)》也曾報(bào)道，蜂毒素可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，并且減少增殖細(xì)胞中和抗原附性細(xì)胞的表達(dá)，影響細(xì)胞周期的比率，為蜂毒素臨床應(yīng)用于抗腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3 蜂毒肽的基因工程

生物工程技術(shù)的發(fā)展為獲得蜂毒肽提供了一條新的途徑，Kindas等從******蜂王的毒腺中提取得到了總mRNA，發(fā)現(xiàn)蜂毒肽mRNA含大約400個(gè)堿基對(duì)和1個(gè)短的poly A尾。Vlasak等用mRNA-DNA逆轉(zhuǎn)錄的方法，利用質(zhì)粒pBR322構(gòu)建了蜂王毒腺的cDNA文庫(kù)，用蜂王毒腺總mRNA制作探針從此文庫(kù)中分離得到了蜂毒肽的cDNA，再進(jìn)一步將其克隆到質(zhì)粒pUC18上進(jìn)行DNA序列分析，由DNA的序列分析結(jié)果推測(cè)出的蜂毒肽序列與實(shí)際測(cè)得的完全相同。張青文從1991年開始提取了蜂王毒腺的RNA，用于棉鈴蟲卵中的轉(zhuǎn)譯，成功地合成了Promelittin，并對(duì)提取的mRNA成分進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總RNA在除去rRNA后就可得到高純度的蜂毒肽mRNA。李繼周等于1997年通過(guò)mRNA-cDNA反轉(zhuǎn)錄的方法合成了蜂毒肽基因，用lgtll 建立了蜂毒肽的cDNA文庫(kù)，并用抗體探針篩選出了附性克隆。陳仲兵等進(jìn)一步將蜂毒肽cDNA克隆到大腸桿菌質(zhì)粒Pucl8上，并進(jìn)行了序列分析。王關(guān)林等從蜜蜂毒腺中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增得到了蜂毒肽前體蛋白的cDNA，再進(jìn)一步通過(guò)定點(diǎn)誘變?cè)诜涠倦男蛄星耙肓私?jīng)胺裂解位點(diǎn)，構(gòu)建了與β-半乳糖昔酶部分序列相融合的蜂毒肽誘變蛋白表達(dá)載體，序列分析結(jié)果表明，成功地引入了目的密碼子，且與β-半乳糖苷酶部分序列構(gòu)成正確的讀碼框，并在大腸桿菌中表達(dá)了誘變蛋白。王關(guān)林克隆了蜂毒肽前體蛋白的cDNA，并在大腸桿菌中表達(dá)了與β-半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽前體蛋白。王秋波等報(bào)道通過(guò)人工合成含特異性酶切位點(diǎn)的AB兩條寡核苦酸片段，在Klenow 酶作用下形成目的基因，用限制型內(nèi)切酶Hind Ⅲ，Xmn Ⅰ同時(shí)酶切目的基因和表達(dá)載體Pmalp2質(zhì)粒，在T4連接酶的作用下構(gòu)建兩者的重組體，通過(guò)α-互補(bǔ)篩選出附性克隆，并通過(guò)特異性酶切和測(cè)序分析進(jìn)行鑒定，獲得重組蜂毒肽的原核表達(dá)克隆。

蜂毒肽的溶血作用限制了它的臨床應(yīng)用。為克服其溶血毒副作用，人們嘗試通過(guò)改變蜂毒素分子構(gòu)像，將蜂毒素分子與腫瘤特異性抗體偶聯(lián)成免疫毒素或制成緩釋劑等方法來(lái)減輕其不良反應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤活性的目的。

趙亞華等為獲得保留有抗菌活性而降低溶血作用的蜂毒素，對(duì)蜂毒素的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造。將第5位的Val變?yōu)锳rg，第15位Ala變?yōu)锳rg，刪除了第16位的Leu。用PCR技術(shù)獲得了改造后的蜂毒素基因，將其克隆人酵母表達(dá)載體pPICZa-A，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒PPICZa-A-MEA。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115，甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)，發(fā)酵上清液經(jīng)抑菌活性、溶血活性測(cè)定及親和層析純化，結(jié)果表明，蜂毒素基因成功地在畢赤酵母中表達(dá)，經(jīng)改造后表達(dá)的蜂毒素保留了抗菌活性且溶血活性顯著降低，經(jīng)純化后用Bradford法測(cè)定表達(dá)蜂毒素的含量約為0.29 mg/mL。

李柏、張晨等應(yīng)用基因工程，構(gòu)建攜蜂毒素基因及甲胎蛋白(AFP)啟動(dòng)子(rAFP)的重組腺病毒載體，探討rAFP驅(qū)動(dòng)的蜂毒素基因在體外對(duì)肝癌細(xì)胞的特異性殺傷作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：攜蜂毒素基因重組腺病毒載體構(gòu)建成功，MTr實(shí)驗(yàn)證明攜蜂毒素基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染后，AFP附性肝癌細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，而對(duì)AFP陰性肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞無(wú)明顯影響；無(wú)蜂毒素基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染，則對(duì)各種細(xì)胞增殖均無(wú)抑制作用，他們等還發(fā)現(xiàn)蜂毒素基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞后，肝癌細(xì)胞周期受到不同程度的影響，Go/G期細(xì)胞增多，細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)標(biāo)記指數(shù)較對(duì)照組明顯下降，提示癌細(xì)胞較多被阻滯于G期，蜂毒素基因在癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)干擾了其細(xì)胞周期，抑制了癌細(xì)胞的增殖，而抑制PCNA的合成可能是其作用機(jī)制之一。細(xì)胞增殖與凋亡的失衡決定了腫瘤的生長(zhǎng)速率。凋亡不僅直接影響著機(jī)體組織的正常發(fā)育、分化與死亡，它在腫瘤治療中的作用已受到極大的重視。研究證明，蜂毒素具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。經(jīng)攜蜂毒素基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染后，倒置相差顯微鏡下觀察到部分肝癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)變化，體積變小、變圓，染色質(zhì)邊集等現(xiàn)象。攜蜂毒素基因重組腺病毒可有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，凋亡率在20％左右，高于不舍蜂毒素基因重組腺病毒和未轉(zhuǎn)染重組腺病毒對(duì)照組，提示誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡亦是蜂毒素基因治療發(fā)揮作用的機(jī)制之一。

4 蜂毒肽的分子生物學(xué)機(jī)制

至今為止，對(duì)于蜂毒素的殺菌及溶血機(jī)理仍然很不確定，以往研究認(rèn)為，抗細(xì)菌素類是通過(guò)穿孔模型形成膜空洞機(jī)制引起殺菌的。但深入研究發(fā)現(xiàn)，有些抗細(xì)菌素與細(xì)胞膜的作用方式與穿孔模型有明顯不同，后來(lái)便提出了一種新的作用模式--地毯模式。

目前，抗細(xì)菌素侵膜機(jī)理占主導(dǎo)地位的觀點(diǎn)仍然是穿孔模型和地毯模式機(jī)理。根據(jù)蜂毒素的這種侵膜機(jī)制，趙亞華等通過(guò)實(shí)驗(yàn)有目的地改造了蜂毒素的氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列以及所要表達(dá)的蜂毒素基因。盡量使蜂毒素在與細(xì)菌細(xì)腦膜相互作用時(shí)，主要采取地毯模式侵膜而引起殺菌，同時(shí)，由于帶電荷數(shù)與分子構(gòu)象的改變，大大降低了它與血細(xì)胞膜兩親性作用的幾率，從而達(dá)到抑制溶血性的目的。改造后的蜂毒素的溶血性與標(biāo)準(zhǔn)樣品的溶血活性相比，有較大幅度降低，大約降低了14.3倍。

蜂毒肽發(fā)揮其眾多功能的主要機(jī)理是因?yàn)榉涠倦目梢允辜?xì)腦膜的透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物泄露，細(xì)胞裂解所以蜂毒肽與天然或是模型膜的作用成為蜂毒肽研究的熱點(diǎn)。Benachir等利用鈣黃綠素作為熒光標(biāo)記物，系統(tǒng)研究了蜂毒肽誘導(dǎo)的膜滲漏。他們認(rèn)為蜂毒肽與囊泡的結(jié)合會(huì)非常迅速，因?yàn)樵诜涠倦淖饔脦追昼娭?，?nèi)容物的流出達(dá)到最大值，并且停止；而且蜂毒肽誘導(dǎo)的磷脂雙分子層的裂解的發(fā)生機(jī)制是“全或無(wú)”，也就是說(shuō)蜂毒肽作用下，有的囊泡的內(nèi)容物全部釋放，而有的則保持完整，沒(méi)有滲漏，這與Schwarz 等觀察的一致。內(nèi)容物釋放的比例與蜂毒肽/脂質(zhì)的摩爾比率有關(guān)，只有達(dá)到一定量的蜂毒肽才可能有內(nèi)容物滲出。更為特別的是蜂毒肽可以區(qū)別出完整的和已經(jīng)有物質(zhì)滲出的囊泡，說(shuō)明這兩類脂質(zhì)雙分子層的性質(zhì)有很大的不同。最近有很多報(bào)道認(rèn)為，微粒表面的負(fù)電荷可以抑制蜂毒肽對(duì)細(xì)胞的裂解作用，Benachir等的工作表明卵磷脂雙分子層表面負(fù)電荷的存在對(duì)蜂毒肽的裂解能力有抑制作用，并且與負(fù)電荷的密度成一定比例。這可能是由于靜電作用吸附蜂毒肽，而不能更加深入破壞囊泡而形成滲漏。

蜂毒肽可以作用多種酶及細(xì)胞蛋白，在裂解的細(xì)胞中蜂毒肽能結(jié)合或改變幾種蛋白質(zhì)功能。如蜂毒肽可以抑制蛋白激酶C；與鈣調(diào)蛋白(calmodulin)具有高度親極性。Fukushi-ma實(shí)驗(yàn)中觀察到蜂毒肽抑制小鼠大腦皮質(zhì)的突觸膜上依賴?guó)B苷酸的腺苷酸環(huán)化酶活性；還發(fā)現(xiàn)蜂毒肽能明顯刺激Gil和Gll活性，但卻抑制Gs活性。動(dòng)力學(xué)研究表明蜂毒肽抑制Gs活性是因?yàn)橐种艷DP的釋放，從而增加了鳥苷酸造成的。而激活Gi與抑制Gs很可能與抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性有關(guān)。細(xì)胞脂酶的活性產(chǎn)物包括三磷酸肌醇(IP3)、甘油二酯(DG)和脂肪酸(FA)等是細(xì)胞生理活動(dòng)重要的第二信使系統(tǒng)，而有實(shí)驗(yàn)表明蜂毒肽可以激活細(xì)胞脂酶，包括磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、磷脂酶Az(PLAJ及甘油三酯酶等。磷脂和甘油三酯是細(xì)胞內(nèi)主要的?；?包含脂肪酸)。而甘油三酯的相對(duì)含量可占細(xì)胞總脂量的5％～60％。

5 總結(jié)

蜂毒肽由于其具有抗炎、殺菌、抗腫瘤等作用，已在醫(yī)療上得到廣泛應(yīng)用，但由于其來(lái)源有限，成本過(guò)高，且有直接溶血作用，應(yīng)用受到嚴(yán)重制約。目前還尚未有完善的方法技術(shù)來(lái)大量生產(chǎn)蜂毒肽。從理論上講，由于蜂毒肽對(duì)生物膜的破壞作用，克隆得到的蜂毒肽cDNA如果直接在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有致死性，因而現(xiàn)在很多學(xué)者都試圖通過(guò)利用基因工程來(lái)改造蜂毒肽的分子結(jié)構(gòu)或構(gòu)象，或是將其融合到其他細(xì)胞基因中，或者表達(dá)其前體蛋白，然后經(jīng)過(guò)適當(dāng)修飾處理獲得對(duì)正常細(xì)胞毒性較小的蜂毒肽。近年來(lái)，通過(guò)基因工程獲得蜂毒肽的方法已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但仍有許多不足之處，距離大規(guī)模生產(chǎn)還有很長(zhǎng)的一段路。如何進(jìn)一步提高基因表達(dá)水平，提高基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性等，是今后值得深入研究的問(wèn)題。

引自《蜜蜂雜志》2007（5）