摘要：咽下腺是蜜蜂(Apis)工蜂合成和分泌蜂王漿的主要腺體，其活力高低直接影響蜂王漿產(chǎn)量。本文就咽下腺分泌活力與工蜂發(fā)育日齡的關(guān)系、分泌蛋白在蜂群中的傳遞規(guī)律、分泌細(xì)胞學(xué)研究、影響咽下腺發(fā)育的因素、分泌活力檢測方法和分泌蛋白的分子生物學(xué)研究進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞：蜜蜂；咽下腺；分泌生理

咽下腺分泌物蜂王漿是工蜂飼喂蜂王、幼蟲的主要食物。咽下腺是一對葡萄狀的泡狀腺，分別盤繞在工蜂頭部前額腔兩側(cè)。近年來，對蜜蜂咽下腺分泌蛋白、分泌生理及分子生物學(xué)的研究成為熱點(diǎn)，在此作一綜述。

1 咽下腺蛋白的分泌及其在蜂群中的傳遞

同位素示蹤技術(shù)被成功地運(yùn)用于蜜蜂咽下腺蛋白的合成、分泌及其在蜂群內(nèi)個體間傳遞的研究。Takennaka(1990)利用體外器官培養(yǎng)測定工蜂一生中咽下腺的蛋白合成情況。通過SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)咽下腺分泌物有22條條帶，分子量范圍為3.0×10 4 Da到19.0×10 4 Da。從王漿蛋白中分離出20條條帶，分子量范圍為3.5×10 4 Da到9.5×10 4 Da。王漿蛋白圖譜與咽下腺分泌蛋白相似，從咽下腺中檢測出葡萄糖氧化酶、淀粉酶、α-葡糖苷酶，但在王漿中只發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶。

Crailsheim(1990)采用14C標(biāo)記的苯丙氨酸注射到8日齡哺育蜂和采集蜂體內(nèi)，90 min后，分析咽下腺蛋白，發(fā)現(xiàn)哺育蜂比采集蜂結(jié)合更多的14C到蛋白中，結(jié)果表明，蜂群內(nèi)成年蜂之間的交哺作用對蛋白質(zhì)的分布起重要的作用。Crailsheim(1991)從蜂群中抓出8日齡工蜂，給它們注射14C-苯丙氨酸，觀察哺育蜂咽下腺蛋白分泌物在蜂群中的分布。兩小時后，40％的放射性活力在它們頭部。把蜜蜂放回蜂群，該蜂群有400～800只工蜂和幼蟲，在接下來的ll h，哺育蜂的放射性活力水平下降；一小部分被傳給蜂王，而更多傳給幼蟲，近1/4的放射性活力無法從哺育蜂中恢復(fù)而以蛋白接合的方式被傳給其它工蜂；近20％的工蜂接受放射性標(biāo)記的食物。哺育蜂還飼喂青年雄蜂。

Crailsheim(1992)從兩個正常蜂群中抓出100只哺育蜂，用14C標(biāo)記的苯丙氨酸注射哺育蜂。這些蜂的一小部分被獨(dú)立分開，其余部分放回蜂群；第二天，測定過夜后的同位素分布。在獨(dú)立分開組中，過2 h 和8 h，在它們的咽下腺和身體蛋白中發(fā)現(xiàn)同位素。交哺的結(jié)果導(dǎo)致蜂群中注射過同位素的哺育蜂喪失同位素，1/2～l/3的同位素分布在其他成年蜂身上，特別是青年蜂和采集蜂，這2群蜂中分別有10％和16％的工蜂含有同位素，其余的同位素分布到幼蟲上。非常小的工蜂幼蟲比大幼蟲含有更少的同位素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與蜂群中的工蜂相比，關(guān)在籠內(nèi)的工蜂體內(nèi)和頭部結(jié)合放射性標(biāo)記的苯丙氨酸的量減少，咽下腺變小，與更老的蜂、更青年的蜂和相同日齡的工蜂關(guān)在一起的結(jié)果相似。Naiem 報道新出房工蜂被關(guān)在與已知日齡的陪伴蜂在籠內(nèi)8 d，陪伴蜂每2 d 換一次，8 d 后，對試驗(yàn)蜂測定各種參數(shù)作為發(fā)育水平的標(biāo)志，與6日齡陪伴蜂關(guān)在一起的試驗(yàn)蜂的發(fā)育狀況好于單獨(dú)、剛出房、或與其他日齡陪伴蜂關(guān)在一起的試驗(yàn)蜂。它們的咽下腺更大，蛋白質(zhì)更多，胸部的蛋白含量更高，中腸蛋白水解的活力更強(qiáng)。結(jié)果表明，即使在人為條件下，食物的交流促進(jìn)青年工蜂的發(fā)育。

2 咽下腺分泌細(xì)胞學(xué)

Kumar(1999)研究飼養(yǎng)在印度坎地加Panjab大學(xué)的東方蜜蜂(Apis cerana Fabr)的7日至13日分泌王漿工蜂的分泌細(xì)胞的特性，按順序分析了分泌物質(zhì)的形態(tài)和細(xì)胞化學(xué)特性，有3種不同的分泌物形態(tài)：顆粒體、小球和包含在分泌物儲存泡內(nèi)的同源物質(zhì)。細(xì)胞化學(xué)檢測表明小的顆粒體和分泌物儲存泡內(nèi)的物質(zhì)是蛋白質(zhì)，小球和大的顆粒體是脂肪，而分泌細(xì)胞基礎(chǔ)的一些大的小球包含糖元。

Moraes分別采用組織學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、順序隧道、膜聯(lián)蛋白V和慧星檢測方法，研究西方蜜蜂咽下腺細(xì)胞死亡的方式。腺體內(nèi)細(xì)胞呈現(xiàn)編程性細(xì)胞死亡、壞死和程序性細(xì)胞液泡死亡方式的特征，發(fā)現(xiàn)哺育蜂和老采集蜂咽下腺細(xì)胞死亡的方式不同。

3 影響咽下腺發(fā)育的因素

3.1 蜜蜂幼蟲信號激活咽下腺發(fā)育

Huang(1989)研究報道，對每個試驗(yàn)蜂群用單層或雙層網(wǎng)眼的紗網(wǎng)分成兩部分，一邊有幼蟲，一邊無幼蟲。用體外生物檢測方法測定各蜂群青年工蜂的咽下腺蛋白合成情況，有幼蟲蜂群中工蜂蛋白合成的量明顯高于無幼蟲蜂群，結(jié)果說明，幼蟲中的信號激活蛋白合成，這種信號不是一種高度易揮發(fā)的化學(xué)物質(zhì)，也不是一種通過交哺作用在工蜂之間傳遞的物質(zhì)?？偟鞍變?nèi)容物與咽下腺合成活力之間有相關(guān)關(guān)系，沒有發(fā)育和肥大咽下腺合成蛋白的活力低于中等發(fā)育程度的咽下腺。Mohammedi(1996)利用從西方蜜蜂雄蜂和工蜂幼蟲的表皮分離出10種脂肪酸酯混合物，用這種混合物和兩種單獨(dú)成分分別加到糖中飼喂由******王和剛出房工蜂組成的蜂群，飼喂幼蟲信息素的第14日齡工蜂的咽下腺內(nèi)容物顯著高于對照組。分別單獨(dú)飼喂乙基油酸酯和甲基軟脂酸，提高咽下腺蛋白內(nèi)容物的閥值濃度分別為120和271幼蟲當(dāng)量/工蜂/天。

3.2 保幼激素直接影響咽下腺發(fā)育Sasagawa(1989)

報道蜜蜂工蜂的日齡行為多態(tài)型及保幼激素(JH)對它的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)表明保幼激素與腺體活力有直接關(guān)系。Sasagawa(1989)報道蜜蜂成年工蜂勞動分工的激素調(diào)控：methoprene對蜜蜂咽側(cè)體和咽下腺及其α-葡糖昔酶活力的影響。給蜜蜂工蜂注射 methoprene(0.1，0.5，1.0，5.0，10.0)，發(fā)現(xiàn)其咽側(cè)體的發(fā)育受抑制；最低劑量刺激咽下腺的發(fā)育，而最高劑量抑制咽下腺的發(fā)育。蜜蜂咽下腺α-葡糖苷酶活力的最高峰在正常蜜蜂中出現(xiàn)在老(采集)蜂階段，通過注射0.1～10.0的 methoprene 的工蜂在1～2星期內(nèi)α-葡糖昔酶活力達(dá)到最高峰。把0日齡用methoprene處理的工蜂介紹到正常蜂群中，守衛(wèi)蜂和采集蜂出現(xiàn)的日齡分別比正常對照蜂群早 7 d 和 5 d。2周齡執(zhí)行不同任務(wù)的工蜂血液中JH合成率和水平明顯不同，泌蠟蜂和貯存食物蜂的JH水平低，而守衛(wèi)蜂和擯葬蜂的JH水平與采集蜂一樣高。咽下腺大小與工蜂日齡和JH生物合成率成反相關(guān)。然而，與采集蜂日齡和JH水平一致的戰(zhàn)斗蜂(從蜂群飛出并螫刺)的咽下腺更大。

3.3 蜂群狀況對咽下腺發(fā)育的影響 Ohashi 報道蜜蜂失王群中工蜂咽下腺的作用靈活性。結(jié)果表明，工蜂咽下腺細(xì)胞的作用具有靈活性，根據(jù)蜂群條件需要，能夠保持與哺育蜂一樣的功能。Liu(1990)報道蜜蜂孢子蟲感染及煙曲霉素處理后工蜂的咽下腺分泌顆粒的超微結(jié)構(gòu)變化。健康工蜂的咽下腺有許多電子致密分泌顆粒，感染蜜蜂孢子蟲后，這些顆粒變大并失去電子致密區(qū)，擁有一個由許多更小顆粒組成的中心核區(qū)和輕電子致密的邊緣區(qū)，有些邊緣區(qū)有結(jié)晶結(jié)構(gòu)。感染蜜蜂用煙曲霉素處理后，咽下腺的分泌顆粒變大、電子致密變輕，但顆粒的內(nèi)容物是均勻的，有些顆粒也有部分的結(jié)晶?；疾∶鄯浜蜔熐顾靥幚砻鄯涞姆置陬w粒的超微結(jié)構(gòu)變化可能與腺體的分泌活力變化有關(guān)。感染了孢子蟲的工蜂的咽下腺分泌物發(fā)生了明顯的變化。Omar(1992)在試驗(yàn)室檢測飼喂“Apitol”(用于治療大蜂螨的蠅毒硫磷的一種劑型)對蜜蜂的影響，發(fā)現(xiàn)喂藥增加蜜蜂的死亡率，特別是連續(xù)喂藥，咽下腺的發(fā)育減緩，直腸的內(nèi)容物和酸度增加。

3.4 不同蜂種咽下腺發(fā)達(dá)程度不同

Yousif(2000)研究埃及不同蜜蜂品種的雜交后代工蜂的咽下腺發(fā)育，發(fā)現(xiàn)喀尼阿蘭的F1代咽下腺最發(fā)達(dá)，而高加索的F1代顯示最小的雜交優(yōu)勢?！罢戕r(nóng)大1號”意蜂品種的工蜂的咽下腺泌漿高峰期持續(xù)時間平均比原意長7～8 d，這可能是“浙農(nóng)大1號”意蜂王漿產(chǎn)量高于原意的重要原因之一。

4 檢測咽下腺分泌活力的方法

Hassanein等(1952)測定咽下腺腺泡大小作為活性高低的標(biāo)志；Pickard(1983)提出把王漿腺的重量作為其活性高低的指標(biāo)；Brouwers(1982)采用同位素示蹤結(jié)合組織培養(yǎng)法測定了了西方蜜蜂王漿腺體外合成蛋白質(zhì)的速率，并以此作為王漿腺的活性指標(biāo)。Huang(1990)報道一種簡便的活體估測蜜蜂咽下腺活力的方法。采用放射性14C-L-亮氨酸被直接注射到蜜蜂的血腔內(nèi)，隨后在蛋白質(zhì)合成中被結(jié)合到咽下腺內(nèi)。經(jīng)過2 h 的培育，檢測腺體結(jié)合放射性亮氨酸的數(shù)量，并作為腺體合成活力的指標(biāo)，這種技術(shù)簡便、快速、可靠。

5 咽下腺分泌蛋白分子生物學(xué)

TaLenaka(1990)報道蜜蜂工蜂一生中葡萄糖氧化酶活力和葡糖酸形成數(shù)量的變化。咽下腺中葡萄糖氧化酶的活力在工蜂出房后迅速增長到第7 d，后開始下降到第15 d，之后又上升，到第23 d 時達(dá)到最大活力。咽下腺葡糖酸合成的數(shù)量變化規(guī)律與此相似。第一個高峰與哺育階段王漿分泌活躍相吻合，第二個高峰發(fā)生在采集釀制蜂蜜階段。ohashi 等報道西方蜜蜂咽下腺α-葡糖苷酶的cDNA分子克隆和基因表達(dá)分析。0hashi(1999)報道西方蜜蜂工蜂咽下腺中淀粉酶和葡萄糖氧化酶隨日齡變化而出現(xiàn)不同的表達(dá)豐度。

蜜蜂咽下腺是分泌蜂王漿的主要腺體。Hanes(1992)率先報道了蜜蜂王漿主蛋白的分離及特性，隨后，對西方蜜蜂(Apis mellifera)的蜂王漿主蛋白基因進(jìn)行了一系列的克隆和分析，目前已經(jīng)克隆王漿蛋白家族的9個成員。我國科技工作者在中華蜜蜂(Apis cerana cerana)王漿主蛋白基因克隆與分析方面也取得突破，已獲得中華蜜蜂5個王漿蛋白基因的cDNA全長序列。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也被應(yīng)用到王漿蛋白研究中，Scarselli R 等用蛋白質(zhì)雙向電泳、質(zhì)譜、de novo測序技術(shù)研究了咽下腺分泌蛋白的蛋白質(zhì)組。

科技工作者開始利用已克隆獲得的蜂王漿主蛋白基因進(jìn)行真核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的功能研究，以揭示王漿蛋白的生物學(xué)功能。隨著分子生物學(xué)研究的深入，蜂王漿蛋白的生物學(xué)功能將最終得到詮釋，為人類的健康事業(yè)做出新的貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)（略）

引自《中國蜂業(yè)》2008（4）

浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 蔡芳 陶挺 陳盛祿 蘇松坤