摘要：美洲幼蟲腐臭病是目前危害蜜蜂幼蟲生長(zhǎng)的主要細(xì)菌病，不合理地使用抗生素防治該病是導(dǎo)致蜂產(chǎn)品抗生素殘留的重要因素。本文介紹了它的病原(Paeniballus larvae subspecieslaevae)和流行病學(xué)特征，并就目前檢測(cè)美洲幼蟲腐臭病痛原和防治該病的研究進(jìn)展做一綜述。

關(guān)鍵詞：美洲幼蟲腐臭病 幼蟲芽孢桿菌 檢測(cè)防治

美洲幼蟲腐臭病(American foulbrood)，簡(jiǎn)稱美幼病，是侵害蜜蜂幼蟲的一種細(xì)菌性病害。被感染的蜜蜂幼蟲平均在孵化后12．5天表現(xiàn)出癥狀，首先體色明顯變化，從正常的珍珠白變黃、淡褐色、褐色甚至黑褐色，同時(shí)蟲體不斷失水干癟，最后成緊貼于巢房壁的、黑褐色的、難以清除的鱗片狀物。該病于1907年確定，目前廣泛發(fā)生于溫帶與亞熱帶地區(qū)的幾乎所有國家，給這些國家的養(yǎng)蜂業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國于1929～1930年間引進(jìn)日本西方蜜蜂蜂種時(shí)將該病帶入，如今受其影響較嚴(yán)重(陳盛祿，2001)。美洲幼蟲腐臭病的病原具有極強(qiáng)的生命力，在曾經(jīng)暴發(fā)美幼病的養(yǎng)蜂主產(chǎn)區(qū)普遍存在，因此，多數(shù)蜂場(chǎng)為防止美幼病的發(fā)生，采用飼喂抗生素的方法，這是造成蜂產(chǎn)品中抗生素殘留的重要因素，如果用藥劑量和時(shí)間稍不注意，就會(huì)引起抗生素殘留超標(biāo)。研究美幼病的病原檢測(cè)方法和防治新技術(shù)對(duì)于準(zhǔn)確對(duì)癥用藥，采用非抗生素藥物防治美幼病，減少或避免抗生素殘留具有重要意義。

1 病原

美洲幼蟲腐臭病由幼蟲芽孢桿菌(Paenibacillus larvae subspecies larvae)引起。它是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，在一定條件下能產(chǎn)生芽孢，而且它產(chǎn)生的芽孢很有特色，一般細(xì)菌的芽孢外面只有4～5層結(jié)構(gòu)包圍，但是幼蟲芽孢桿菌的芽孢卻有7層結(jié)構(gòu)包圍，這種特殊的構(gòu)造使得幼蟲芽孢桿菌的芽孢具有特別強(qiáng)的生命力，而且它對(duì)熱、化學(xué)消毒劑等都具有極強(qiáng)的抵抗力，在熱、干燥等惡劣環(huán)境下至少能存活35年。

目前已知幼蟲芽孢桿菌的基因型至少有5種，且不同基因型的細(xì)菌株系所導(dǎo)致的美洲幼蟲腐臭病的流行情況略有不同(Genersch E 等，2003；NeuenJorf S 等，2004)。不同基因型的幼蟲芽孢桿菌可以通過PCR技術(shù)和16SrRNA的編碼基因的限制性酶切片段多態(tài)性加以區(qū)別鑒定。

2 流行病學(xué)特征

美洲幼蟲腐臭病病害的流行是由幼蟲芽孢桿菌的芽孢引起的，而不是它的營養(yǎng)體。原因可能是蜜蜂幼蟲的食物具有一定的殺菌作用，比如花粉和蜂王漿中的一些脂肪酸和抗菌肽物質(zhì)，它們對(duì)幼蟲芽孢桿菌的營養(yǎng)體有抑制和殺滅的作用(Manning R，2001；Bililtova K 等，2001；Bachanova K 等，2002)。

芽孢被蜜蜂幼蟲取食后，就在幼蟲的中腸萌發(fā)，然后穿過小腸組織，開始快速繁殖，最后殺死蜜蜂幼蟲。對(duì)芽孢的萌發(fā)來說，日齡越小的幼蟲其萌發(fā)條件越好，但對(duì)營養(yǎng)生長(zhǎng)來說，則是老熟幼蟲最適宜。這是因?yàn)檠挎叩拿劝l(fā)需要一個(gè)低氧壓的環(huán)境，而生長(zhǎng)、繁殖及產(chǎn)生芽孢則需要高氧壓的環(huán)境(陳盛祿，2001)。所以不同蟲齡的蜜蜂幼蟲對(duì)幼蟲芽孢桿菌的敏感性差異非常大，1日齡的幼蟲對(duì)幼蟲芽孢桿菌高度敏感，通常只要不足10個(gè)芽孢就能使之患病，但是侵染2日齡以上的幼蟲，則需要數(shù)以百計(jì)的芽孢(Evans，2004)。另外有研究發(fā)現(xiàn)，成蟲蜜蜂對(duì)幼蟲芽孢桿菌有抵抗作用，原因是它們的中腸能產(chǎn)生一些可以抑制幼蟲芽孢桿菌生長(zhǎng)和芽孢發(fā)育的物質(zhì)。

幼蟲芽孢桿菌在蜜蜂群內(nèi)的傳播可以是水平的，即通過錯(cuò)投和盜蜂傳播，也可以是垂直的，即通過分蜂傳播，而在群間的傳播則主要是通過垂直傳播(Fries I 等，2001)。幼蟲芽孢桿菌的這種傳播方式使得它成為蜜蜂一種傳染性極強(qiáng)的疾病。由于芽孢只要在適宜的環(huán)境下就能萌發(fā)，所以美洲幼蟲腐臭病的發(fā)生沒有一定的季節(jié)性，病害能在一年中的任何一個(gè)有幼蟲的季節(jié)都有可能發(fā)生，但是一般在夏、秋季節(jié)發(fā)生的相對(duì)較多。氣候和蜜源對(duì)其發(fā)生有一定的影響，病群在優(yōu)質(zhì)蜜源大流蜜期到來時(shí)，病情會(huì)減輕，有些甚至能“自愈”，其原因主要有：①芽孢可能被采進(jìn)的花蜜稀釋，從而降低了幼蟲從食物中接觸芽孢的機(jī)會(huì)；②花蜜的充盈刺激了蜂群中內(nèi)勤蜂的清潔行為，內(nèi)勤蜂發(fā)現(xiàn)和消除病蟲的能力增強(qiáng)；②剛采回的花粉作為幼蟲的食物，在一定程度上也減少了幼蟲被芽孢侵染的機(jī)會(huì)(Fries I 等，2001)。

3 病原鑒定

對(duì)于幼蟲芽孢桿菌的鑒定，早些時(shí)候一般先對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后進(jìn)一步通過生化手段進(jìn)行鑒定。但是由于幼蟲芽孢桿菌芽孢的生長(zhǎng)比較特殊，它需要復(fù)雜的營養(yǎng)，在普通培養(yǎng)基上不能萌發(fā)也不能形成芽孢，需要專用的培養(yǎng)基，而且它的生長(zhǎng)速度很慢，所以這樣的方法顯然比較花時(shí)間，而且還要依賴后面一系列復(fù)雜的生化方法。

于是就有人試圖發(fā)展一種選擇性培養(yǎng)基，希望通過分離培養(yǎng)就能鑒定出幼蟲芽孢桿菌，而不再需要接下來的生化鑒定。在這些探索中比較成功的是Alippi在1995年發(fā)明的一種半選擇性培養(yǎng)基。他在培養(yǎng)基中加了萘啶酮酸和pipennedic酸，由于幼蟲芽孢桿菌的生長(zhǎng)比較特殊，它可以在加了萘啶酮酸和pipeMedic酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而其他大多數(shù)細(xì)菌則不能，從而可以將它們分離開。雖然這種方法相對(duì)比較簡(jiǎn)便，但是卻不可避免的存在一定的假陽性現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上，在1999年，Govan V A 等報(bào)道可以使用PCR技術(shù)來分辨培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)的真假陽性，從而增加了上述方法的可信度間。

1999年，Stahly等從NE株系的幼蟲芽孢桿菌中分離得到了幼蟲芽孢桿菌噬菌體的致命性突變體PPLlc，并且證實(shí)幼蟲芽孢桿菌的幾乎所有株系都對(duì)PPLlc敏感，而其他細(xì)菌對(duì)PPLlc有抗性。這樣就使幼蟲芽孢桿菌培養(yǎng)后的鑒定變得更加簡(jiǎn)單方便了，只要看是否有噬菌斑的出現(xiàn)就可以了。

但是上述這些方法的使用都需要幼蟲芽孢桿菌的培養(yǎng)，而前面已經(jīng)提到幼蟲芽孢桿菌的培養(yǎng)是比較麻煩的，PCR技術(shù)的使用就克服了這一困難，它可以不需要經(jīng)過培養(yǎng)，就能直接對(duì)蜂蜜中的芽孢進(jìn)行鑒定。

2001年，Dobbelaere W等發(fā)展了一種以16Sr—RNA的編碼基因?yàn)橐锏腜CR技術(shù)來鑒定幼蟲芽孢桿菌的方法，實(shí)驗(yàn)證明該方法快速、可靠，在4小時(shí)內(nèi)就能做出正確的診斷。此后，Piccini C 等(2002)、Bakonyi T 等(2003)、AlipPi A M 等(2004)也相繼報(bào)道了可以使用PCR技術(shù)對(duì)蜂蜜中的芽孢進(jìn)行快速直接鑒定。通過這些PCR技術(shù)的改進(jìn)和引物的改良，現(xiàn)在我們已經(jīng)可以在蜜蜂幼蟲尚未發(fā)病的時(shí)候檢測(cè)出低含量的芽孢，從而能夠防患于未然，控制美洲幼蟲腐臭病的大規(guī)模流行。

4 防治

由于美洲幼蟲腐臭病的存在歷史已經(jīng)比較悠久，而且它的傳染性極強(qiáng)，破壞力很大，所以如何來有效的防治它是人們一直以來都非常關(guān)心的問題，相關(guān)的研究報(bào)道也很多，而其中研究最多的莫過于抗生素的使用。

早在1944年 Haseman 等就介紹用硫胺噻唑來治療美洲幼蟲腐臭病，1951年 Gochnauer 等報(bào)道土霉素治療美洲幼蟲腐臭病非常有效，而后的幾十年人們就普遍使用土霉素來防治美洲幼蟲腐臭病。但是近些年來人們?cè)絹碓蕉嗟挠龅搅耸褂猛撩顾刂委熋乐抻紫x腐臭病效果下降的情況，有時(shí)甚至完全失效，后來證實(shí)是幼蟲芽孢桿菌對(duì)土霉素產(chǎn)生了抗性。

如何控制已經(jīng)對(duì)土霉素產(chǎn)生了抗性的美洲幼蟲腐臭病成為蜂病防治的新課題。很多人將注意力投向了使用其他的抗生素來代替土霉素。2001年，F(xiàn)eldlaufer M F 等報(bào)道鹽酸林可霉素(lincomycin hy—drochloride)能有效地控制美洲幼蟲腐臭病，而且對(duì)蜜蜂的生長(zhǎng)沒有毒性間。2002年，Elzen P 等報(bào)道泰樂菌素(tylosin)對(duì)控制有土霉素抗性的美洲幼蟲腐臭病很有效，而且它對(duì)蜜蜂的生長(zhǎng)也沒有毒性。然而這些候選抗生素的發(fā)現(xiàn)或許會(huì)在一定時(shí)期內(nèi)有效，但卻不能從根本上解決問題，因?yàn)樾碌目股氐氖褂猛瑯舆€存在會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗性的問題。

此外，抗生素的使用還有另外一個(gè)普遍的問題，就是抗生素會(huì)在蜂蜜中殘留，從而影響蜂產(chǎn)品的質(zhì)量。相關(guān)的研究報(bào)道也很多，目前主要是通過HPLC—MS/MS方法來鑒定和測(cè)量蜂蜜中殘留的抗生素(Benetti C 等，2004；Ortelli D 等，2005)。最近，Kochansky J 報(bào)道泰樂菌素在蜂蜜中的降解很慢，它在34℃環(huán)境下轉(zhuǎn)變?yōu)槊撎棵固翘肪?desmycosin)的半衰期大約是4個(gè)月，而脫炭霉糖泰樂菌素在蜂蜜中相當(dāng)穩(wěn)定，在處理9個(gè)月以后，兩者在蜂蜜中的總量只減少了一點(diǎn)點(diǎn)。所以在使用泰樂菌素來治療美洲幼蟲腐臭病一定要小心它在蜂蜜中長(zhǎng)期殘留的問題。

既然抗生素的使用存在上述兩個(gè)很難解決的問題，所以我們不能長(zhǎng)期依賴抗生素來防治美洲幼蟲腐臭病，于是就試圖去尋找其他藥物和途徑。2001年，Bilikova K 等報(bào)道分離自蜂王漿中的一個(gè)多膚片段可以做為抑制美洲幼蟲腐臭病的潛在因子。2002年，Bachanova K 等通過多聚酰胺凝膠上細(xì)菌生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)證實(shí)了蜂王漿中的抗菌肽抑制幼蟲芽孢桿菌生長(zhǎng)的活性。2004年，Gallardo G L 等報(bào)道分離自蜂房花粉中兩個(gè)真菌株系的L—細(xì)交鏈孢菌酮酸(L－TenuMonicacid)表現(xiàn)出了對(duì)幼蟲芽孢桿菌生長(zhǎng)的特殊抑制能力，其最小抑制濃度為32ug/mL，比現(xiàn)在普遍使用的土霉素的最小抑制濃度小。2004年，Aonstein K A 等報(bào)道蒜素(Allicin)具有抑制幼蟲芽孢桿菌生長(zhǎng)的潛力，能在一定程度上減少美洲幼蟲腐臭病的發(fā)生。

除了使用藥物外，還可以輔助使用其他一些途徑。2001年，Del Hoyo M L 等就報(bào)道通過搬運(yùn)感染美洲幼蟲腐臭病的蜂群到新的蜂場(chǎng)能夠減少其芽孢的攜帶量。同年，Spivak M等報(bào)道有衛(wèi)生行為的蜂群抵制美洲幼蟲腐臭病有很大作用，有衛(wèi)生行為的蜂群感染美洲幼蟲腐臭病的機(jī)率相對(duì)較小，而痊愈的機(jī)率則相對(duì)較大，而且產(chǎn)生蜂蜜的量也相對(duì)較多。

5 展望

隨著幼蟲芽孢桿菌對(duì)土霉素抗性的日益增強(qiáng)，迫切需要尋找新的藥物來代替，或者采用有效的飼養(yǎng)管理和育種技術(shù)來控制美幼病的發(fā)生。雖然相關(guān)的研究比較多，但是到目前為止還未得到大家普遍公認(rèn)的安全高效的抗菌藥物，土霉素仍然是目前廣大蜂農(nóng)普遍使用的抗菌藥。所以如何有效地篩選出安全高效的蜂用抗菌藥物，并研究出其最佳的用藥時(shí)間、用藥劑量、用藥方法，從而制定出一套科學(xué)的規(guī)范的方案對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的意義。另外，由于中草藥在中國的獨(dú)特地位，加上它長(zhǎng)期使用不會(huì)產(chǎn)生抗性的優(yōu)良特性，我們可以嘗試著尋找有效的中草藥來防治美洲幼蟲腐臭病。

引自《中國蜂業(yè)》2007（8）