蜂王漿新鮮度指標(biāo)和評(píng)價(jià)方法研究
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蜂王漿的新鮮度與其品質(zhì)密切相關(guān)，其新鮮度指標(biāo)和評(píng)價(jià)方法已成為國內(nèi)外蜂王漿研究的熱點(diǎn)之一。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所副研究員、浙江大學(xué)在職博士吳黎明今年6月通過了其《蜂王漿新鮮度指標(biāo)和評(píng)價(jià)方法研究》的博士論文答辯,受到了專家的一致好評(píng)。該論文利用液相色譜和紅外光譜技術(shù)，從微觀到宏觀，從定性、半定量到定量建立了多種評(píng)判蜂王漿新鮮度的方法，為進(jìn)一步進(jìn)行蜂王漿新鮮度和品質(zhì)相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)，也為完善現(xiàn)行蜂王漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。 長期的科學(xué)研究和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，蜂王漿的品質(zhì)和保健功效易受其貯存條件的影響。若貯存溫度過高或時(shí)間過長，蜂王漿的物理性狀、化學(xué)組成會(huì)發(fā)生變化，保健功效降低甚至喪失。也就是說，蜂王漿的新鮮度與其品質(zhì)密切相關(guān)，并具有一定的正相關(guān)性。但迄今為止，尚沒有一個(gè)公認(rèn)的蜂王漿新鮮度的控制指標(biāo)，也沒有一種適合的評(píng)價(jià)方法。缺少新鮮度指標(biāo)及相應(yīng)的評(píng)價(jià)方法是現(xiàn)行蜂王漿國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一大缺陷，也使質(zhì)量監(jiān)管部門及加工、貿(mào)易企業(yè)無法在蜂王漿生產(chǎn)和流通過程中進(jìn)行有效地監(jiān)管和控制，難以對(duì)蜂王漿質(zhì)量做出準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。因此，探求并確立能如實(shí)反映蜂王漿新鮮度的指標(biāo)及評(píng)價(jià)方法是蜂王漿研究的一項(xiàng)重要課題，也是完善現(xiàn)行蜂王漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效監(jiān)控蜂王漿質(zhì)量，進(jìn)一步規(guī)范蜂王漿市場的關(guān)鍵所在。 針對(duì)上述問題，本文利用液相色譜技術(shù)對(duì)不同貯存條件下的蜂王漿中6種糠醛和26種氨基酸進(jìn)行了定量分析和比較，同時(shí)利用紅外光譜技術(shù)對(duì)不同貯存條件下的蜂王漿進(jìn)行了相關(guān)分析和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定，初步建立了蜂王漿新鮮度監(jiān)控的方法。研究結(jié)果如下：
1. 選定有可能反映蜂王漿新鮮度的糠醛類物質(zhì)為研究對(duì)象，建立了同時(shí)測定蜂王漿中5-羥甲基-2-糠醛 (5-HMF)、5-甲基糠醛 (5-MF)、2-糠醛 (F)、2-糠酸 (2-OIC)、3-糠酸 (3-OIC)、5-羥甲基-2-糠酸 (5-HMFacid) 6種糠醛類物質(zhì)含量的高效液相色譜分析方法。蜂王漿樣品用去離子水提取，離心沉淀后，取上清液加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉降蛋白，0.45 μm濾膜過濾，用高效液相色譜儀在不同波長下測定。在測試范圍內(nèi)，6種糠醛類物質(zhì)的濃度與相應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) (R2) 不小于0.9993。方法定量和定性檢出限分別在0.07～0.26 μg/mL和0.02～0.08 μg/mL之間，加標(biāo)回收率為86.2%～99.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.40%。方法操作簡單，靈敏度高，是一種適合蜂王漿中糠醛類化合物測定的方法。 利用該方法定量測定了在不同溫度下 (-18℃，4℃，16℃和25℃) 經(jīng)過不同時(shí)間 (1，3，6，9和12個(gè)月) 貯存的蜂王漿中6種糠醛類物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，在新采收的蜂王漿中沒有檢出這6種化合物；而在經(jīng)過不同時(shí)間貯存后，4個(gè)溫度梯度的樣品中均檢出了5-HMF，其含量隨著貯存時(shí)間增加和溫度升高而增加；在12個(gè)月的試驗(yàn)期內(nèi)，僅在25℃下貯存的蜂王漿中檢出了F。根據(jù)5-HMF和F含量與貯存時(shí)間和溫度的相關(guān)性，結(jié)合蜂王漿貯存的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，本文提出以5-HMF和F作為評(píng)價(jià)蜂王漿新鮮度的指標(biāo)，并初步確定5-HMF含量小于150 μg/kg和F不得檢出作為評(píng)判蜂王漿是否新鮮的標(biāo)準(zhǔn)。
2. 選定可能能代表蜂王漿新鮮度的26種氨基酸，探索了它們的提取過程以及利用超高效液相色譜 (UPLC) 分析的條件，建立了一種分析蜂王漿中26種氨基酸的UPLC分析方法。該方法采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC) 柱前衍生，通過梯度洗脫，使用ACCQ?Tag C18氨基酸分析柱在8 min以內(nèi)同時(shí)分離并定量測定了蜂王漿中的26種氨基酸含量。在測試范圍內(nèi)，26種氨基酸的濃度與相應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) (R2) 不小于0.9978。方法定量 (LOQ) 和定性檢出限 (LOD) 分別在42.7～235.1 ng/mL和12.9～69.3 ng/mL之間，加標(biāo)回收率為90.1%～100.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.8%。方法操作簡單，耗時(shí)短，靈敏度高，是一種適合蜂王漿的氨基酸測定方法。
利用該方法定量測定了在不同溫度下 (-18℃，4℃和25℃) 經(jīng)過不同時(shí)間 (1，3，6和10個(gè)月) 貯存的蜂王漿中游離氨基酸和總氨基酸含量。結(jié)果表明，新鮮蜂王漿的游離氨基酸和總氨基酸總量分別為9.21 mg/g和111.27 mg/g；其中最主要的游離氨基酸為Pro、Gln、Lys和Glu，而含量最高的總氨基酸分別為Asp、Glu、Lys和Leu。盡管多數(shù)游離氨基酸和總氨基酸含量在蜂王漿的貯存過程中并沒有發(fā)生明顯的變化或變化無規(guī)律，但總Met和游離Gln在貯存過程中含量持續(xù)下降而且差異顯著。因此，本文提出總Met和游離Gln有可能作為評(píng)價(jià)蜂王漿品質(zhì)和新鮮度的指標(biāo)。
3. 測定了在不同溫度下經(jīng)過不同時(shí)間貯存后蜂王漿的Fourier變換紅外光譜，以新采收蜂王漿的紅外譜圖為參考標(biāo)準(zhǔn)譜，利用光譜比對(duì)軟件進(jìn)行了一系列的相關(guān)分析，同時(shí)比較了紅外譜圖中1647、1541、1409、1247和1054 cm-1 5個(gè)峰位的相對(duì)峰強(qiáng)。結(jié)果表明：不同貯存條件下的蜂王漿紅外譜圖之間存在著明顯差異；紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶 (1700～1600 cm-1) 波段的相關(guān)系數(shù)隨著蜂王漿貯存時(shí)間延長和溫度升高而降低；相對(duì)峰強(qiáng)度I1647/I1541、I1647/I1409、I1647/I1247和I1647/I1054也隨著蜂王漿貯存時(shí)間延長和溫度升高而降低，且與貯存時(shí)間存在著良好的線性關(guān)系，變化幅度為28℃＞16℃＞4℃＞-18℃。因此，初步選定紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶特征波段的相關(guān)系數(shù)和4個(gè)相對(duì)峰強(qiáng)度（I1647/I1541、I1647/I1409、I1647/I1247和I1647/I1054）作為蜂王漿新鮮度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)的閾值設(shè)定為0.9100，4個(gè)相對(duì)峰強(qiáng)度的閾值分別設(shè)定為1.744、2.430、3.345和1.412。只要有1個(gè)或多個(gè)指標(biāo)低于相應(yīng)的閾值，可初步判定此蜂王漿是不新鮮的。該方法利用FTIR光譜法并結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助解析技術(shù)能從宏觀上和整體上快速地評(píng)價(jià)蜂王漿的新鮮度。
4. 測定了在不同溫度下經(jīng)過不同時(shí)間貯存后蜂王漿Fourier變換紅外光譜圖，應(yīng)用去卷積和曲線擬合方法對(duì)蜂王漿的酰胺Ⅰ帶進(jìn)行了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，半定量地分析了在不同儲(chǔ)存條件下蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量的變化規(guī)律。結(jié)果表明：經(jīng)過不同條件貯存的蜂王漿蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量存在顯著差異。隨著貯存時(shí)間增加和溫度升高，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋相對(duì)含量顯著減少，而β-折疊相對(duì)含量顯著增加。其變化幅度為28℃＞16℃＞4℃＞-18℃。因此，F(xiàn)TIR光譜法結(jié)合去卷積和曲線擬合技術(shù)可以對(duì)蜂王漿中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行宏觀評(píng)價(jià)和進(jìn)行半定量分析，也可以作為蜂王漿新鮮度評(píng)價(jià)的參考依據(jù)。 綜上所述，本文利用液相色譜法分析測定了不同條件下貯存的蜂王漿6種糠醛類物質(zhì)和26種氨基酸的含量，選定了5-HMF、F、總Met和游離Gln作為蜂王漿新鮮度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，并設(shè)定了相應(yīng)的閾值；同時(shí)利用紅外光譜法并結(jié)合相關(guān)分析和曲線擬合技術(shù)分析了在不同貯存條件下蜂王漿紅外譜圖的相關(guān)性和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化規(guī)律。本文利用液相色譜和紅外光譜技術(shù)，從微觀到宏觀，從定性、半定量到定量建立了多種評(píng)判蜂王漿新鮮度的簡單易行方法，為進(jìn)一步進(jìn)行蜂王漿新鮮度和品質(zhì)相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)，也為完善現(xiàn)行蜂王漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如實(shí)評(píng)價(jià)和有效監(jiān)控蜂王漿質(zhì)量，進(jìn)一步規(guī)范蜂王漿市場提供了理論依據(jù)。
1. 選定有可能反映蜂王漿新鮮度的糠醛類物質(zhì)為研究對(duì)象，建立了同時(shí)測定蜂王漿中5-羥甲基-2-糠醛 (5-HMF)、5-甲基糠醛 (5-MF)、2-糠醛 (F)、2-糠酸 (2-OIC)、3-糠酸 (3-OIC)、5-羥甲基-2-糠酸 (5-HMFacid) 6種糠醛類物質(zhì)含量的高效液相色譜分析方法。蜂王漿樣品用去離子水提取，離心沉淀后，取上清液加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉降蛋白，0.45 μm濾膜過濾，用高效液相色譜儀在不同波長下測定。在測試范圍內(nèi)，6種糠醛類物質(zhì)的濃度與相應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) (R2) 不小于0.9993。方法定量和定性檢出限分別在0.07～0.26 μg/mL和0.02～0.08 μg/mL之間，加標(biāo)回收率為86.2%～99.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.40%。方法操作簡單，靈敏度高，是一種適合蜂王漿中糠醛類化合物測定的方法。 利用該方法定量測定了在不同溫度下 (-18℃，4℃，16℃和25℃) 經(jīng)過不同時(shí)間 (1，3，6，9和12個(gè)月) 貯存的蜂王漿中6種糠醛類物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，在新采收的蜂王漿中沒有檢出這6種化合物；而在經(jīng)過不同時(shí)間貯存后，4個(gè)溫度梯度的樣品中均檢出了5-HMF，其含量隨著貯存時(shí)間增加和溫度升高而增加；在12個(gè)月的試驗(yàn)期內(nèi)，僅在25℃下貯存的蜂王漿中檢出了F。根據(jù)5-HMF和F含量與貯存時(shí)間和溫度的相關(guān)性，結(jié)合蜂王漿貯存的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，本文提出以5-HMF和F作為評(píng)價(jià)蜂王漿新鮮度的指標(biāo)，并初步確定5-HMF含量小于150 μg/kg和F不得檢出作為評(píng)判蜂王漿是否新鮮的標(biāo)準(zhǔn)。
2. 選定可能能代表蜂王漿新鮮度的26種氨基酸，探索了它們的提取過程以及利用超高效液相色譜 (UPLC) 分析的條件，建立了一種分析蜂王漿中26種氨基酸的UPLC分析方法。該方法采用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC) 柱前衍生，通過梯度洗脫，使用ACCQ?Tag C18氨基酸分析柱在8 min以內(nèi)同時(shí)分離并定量測定了蜂王漿中的26種氨基酸含量。在測試范圍內(nèi)，26種氨基酸的濃度與相應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) (R2) 不小于0.9978。方法定量 (LOQ) 和定性檢出限 (LOD) 分別在42.7～235.1 ng/mL和12.9～69.3 ng/mL之間，加標(biāo)回收率為90.1%～100.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.8%。方法操作簡單，耗時(shí)短，靈敏度高，是一種適合蜂王漿的氨基酸測定方法。
利用該方法定量測定了在不同溫度下 (-18℃，4℃和25℃) 經(jīng)過不同時(shí)間 (1，3，6和10個(gè)月) 貯存的蜂王漿中游離氨基酸和總氨基酸含量。結(jié)果表明，新鮮蜂王漿的游離氨基酸和總氨基酸總量分別為9.21 mg/g和111.27 mg/g；其中最主要的游離氨基酸為Pro、Gln、Lys和Glu，而含量最高的總氨基酸分別為Asp、Glu、Lys和Leu。盡管多數(shù)游離氨基酸和總氨基酸含量在蜂王漿的貯存過程中并沒有發(fā)生明顯的變化或變化無規(guī)律，但總Met和游離Gln在貯存過程中含量持續(xù)下降而且差異顯著。因此，本文提出總Met和游離Gln有可能作為評(píng)價(jià)蜂王漿品質(zhì)和新鮮度的指標(biāo)。
3. 測定了在不同溫度下經(jīng)過不同時(shí)間貯存后蜂王漿的Fourier變換紅外光譜，以新采收蜂王漿的紅外譜圖為參考標(biāo)準(zhǔn)譜，利用光譜比對(duì)軟件進(jìn)行了一系列的相關(guān)分析，同時(shí)比較了紅外譜圖中1647、1541、1409、1247和1054 cm-1 5個(gè)峰位的相對(duì)峰強(qiáng)。結(jié)果表明：不同貯存條件下的蜂王漿紅外譜圖之間存在著明顯差異；紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶 (1700～1600 cm-1) 波段的相關(guān)系數(shù)隨著蜂王漿貯存時(shí)間延長和溫度升高而降低；相對(duì)峰強(qiáng)度I1647/I1541、I1647/I1409、I1647/I1247和I1647/I1054也隨著蜂王漿貯存時(shí)間延長和溫度升高而降低，且與貯存時(shí)間存在著良好的線性關(guān)系，變化幅度為28℃＞16℃＞4℃＞-18℃。因此，初步選定紅外光譜圖中酰胺Ⅰ帶特征波段的相關(guān)系數(shù)和4個(gè)相對(duì)峰強(qiáng)度（I1647/I1541、I1647/I1409、I1647/I1247和I1647/I1054）作為蜂王漿新鮮度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，相關(guān)系數(shù)的閾值設(shè)定為0.9100，4個(gè)相對(duì)峰強(qiáng)度的閾值分別設(shè)定為1.744、2.430、3.345和1.412。只要有1個(gè)或多個(gè)指標(biāo)低于相應(yīng)的閾值，可初步判定此蜂王漿是不新鮮的。該方法利用FTIR光譜法并結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助解析技術(shù)能從宏觀上和整體上快速地評(píng)價(jià)蜂王漿的新鮮度。
4. 測定了在不同溫度下經(jīng)過不同時(shí)間貯存后蜂王漿Fourier變換紅外光譜圖，應(yīng)用去卷積和曲線擬合方法對(duì)蜂王漿的酰胺Ⅰ帶進(jìn)行了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，半定量地分析了在不同儲(chǔ)存條件下蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量的變化規(guī)律。結(jié)果表明：經(jīng)過不同條件貯存的蜂王漿蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量存在顯著差異。隨著貯存時(shí)間增加和溫度升高，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋相對(duì)含量顯著減少，而β-折疊相對(duì)含量顯著增加。其變化幅度為28℃＞16℃＞4℃＞-18℃。因此，F(xiàn)TIR光譜法結(jié)合去卷積和曲線擬合技術(shù)可以對(duì)蜂王漿中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行宏觀評(píng)價(jià)和進(jìn)行半定量分析，也可以作為蜂王漿新鮮度評(píng)價(jià)的參考依據(jù)。 綜上所述，本文利用液相色譜法分析測定了不同條件下貯存的蜂王漿6種糠醛類物質(zhì)和26種氨基酸的含量，選定了5-HMF、F、總Met和游離Gln作為蜂王漿新鮮度的評(píng)價(jià)指標(biāo)，并設(shè)定了相應(yīng)的閾值；同時(shí)利用紅外光譜法并結(jié)合相關(guān)分析和曲線擬合技術(shù)分析了在不同貯存條件下蜂王漿紅外譜圖的相關(guān)性和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化規(guī)律。本文利用液相色譜和紅外光譜技術(shù)，從微觀到宏觀，從定性、半定量到定量建立了多種評(píng)判蜂王漿新鮮度的簡單易行方法，為進(jìn)一步進(jìn)行蜂王漿新鮮度和品質(zhì)相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)，也為完善現(xiàn)行蜂王漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，如實(shí)評(píng)價(jià)和有效監(jiān)控蜂王漿質(zhì)量，進(jìn)一步規(guī)范蜂王漿市場提供了理論依據(jù)。
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