蜂膠HPLC指紋圖譜真?zhèn)舞b別初探

周 萍  章征天  胡福良  余秀珍

   蜂膠的化學(xué)含有復(fù)雜，生物學(xué)活性廣泛，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外蜂產(chǎn)品研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。我國(guó)是蜂膠生產(chǎn)大國(guó)，近年來(lái)蜂膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，出現(xiàn)出口內(nèi)銷兩旺的勢(shì)頭。在這樣的背景下，由于利益的驅(qū)動(dòng)，一些不法商販見(jiàn)機(jī)制假售假，特別是以楊樹(shù)膠冒充蜂膠的情況比較嚴(yán)重。如何提高蜂膠原料的質(zhì)量，打擊假冒偽劣蜂膠產(chǎn)品，是擺在我們面前嚴(yán)峻而緊迫的任務(wù)。

    目前，我國(guó)的蜂膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有兩個(gè)，分別是商業(yè)部的蜂膠標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)代號(hào)：SB/T10096-92)和農(nóng)業(yè)部的無(wú)公害食品蜂膠標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)代號(hào)：NY/T5136-2002)。但這兩個(gè)蜂膠標(biāo)準(zhǔn)均無(wú)法鑒別蜂膠與楊樹(shù)膠，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的膠含量、總黃酮、氧化指標(biāo)等項(xiàng)目，楊樹(shù)膠均能達(dá)到。因此，建立真品蜂膠的HPLC指紋圖譜，用以鑒別蜂膠真?zhèn)物@得十分必要和迫切。

    我們從蜂膠的功效含有——黃酮類化合物著手，測(cè)定了真品蜂膠、楊樹(shù)膠和攙假蜂膠膠的HPLC指紋圖譜，為蜂膠真?zhèn)蔚挠行цb別提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    蜂膠：真品蜂膠，由杭州天地保健品有限公司實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)提供。楊樹(shù)膠，從市場(chǎng)上購(gòu)入，經(jīng)感官檢驗(yàn)，初步確認(rèn)。攙假蜂膠，按30%楊樹(shù)膠與70%真品蜂膠混合而成。

    試劑：甲醇，HPLC級(jí)；H₃PO₄，分析純；乙醇，分析純。

    儀器：LC-10AT VP高效液相色譜儀(日本島津)，UV檢測(cè)器，N2000色譜工作站，METERLER電子分析天平(德國(guó)梅特勒公司)，超聲波儀，雙重蒸餾水器。

    1.2 方法

    1.2.1 色譜條件

    色譜柱：Hypersil RP-C18(4.6mm×150mm，3μm)

    流動(dòng)相：甲醇：0.4%H₃PO₄=65:35

    流速：1.0ml/min

    檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm

    進(jìn)樣量：2μL

    1.2.2 供試品制備

    取蜂膠5g，用20mL95%乙醇超聲溶解，過(guò)濾，測(cè)定蜂膠固形物，稱取該液適量，使其中含蜂膠固形物20mg，用流動(dòng)相定容至50ml，混勻，用0.45μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 蜂膠HPLC指紋圖譜的建立

    蜂膠HPLC圖譜以360nm波長(zhǎng)檢測(cè)色譜信息最為豐富，經(jīng)多批次樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)，歸納出19個(gè)峰，作為主要特征峰，組成其指紋圖譜。這19個(gè)特征峰的峰號(hào)和保留時(shí)間見(jiàn)表1。

表1  蜂膠HPLC特征峰峰號(hào)和保留時(shí)間

    2.2 真品蜂膠與楊樹(shù)膠HPLC指紋圖譜分析(圖略)

    楊樹(shù)膠、真品蜂膠的指紋圖譜見(jiàn)圖1、圖2。粗看2個(gè)圖譜，其主要色譜峰相似度在90%以上，說(shuō)明兩者在主要含有的組成上非常接近，這也是兩者普通方法難以區(qū)別的原因。但仔細(xì)觀察可以發(fā)現(xiàn)，真品蜂膠含有19個(gè)特征峰中的18個(gè)特征峰，缺6號(hào)峰；楊樹(shù)膠含有19個(gè)特征峰中的17個(gè)特征峰，缺7號(hào)和11號(hào)峰。通過(guò)對(duì)10個(gè)真品蜂膠和楊樹(shù)膠的測(cè)定，均有以上特征。特別是7噸峰，其與6號(hào)、8號(hào)之間的分離度好，是真品蜂膠區(qū)別楊樹(shù)膠的關(guān)鍵依據(jù)。

    2.3 攙假蜂膠的辨別(圖略)

    攙假蜂膠的HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，攙了楊樹(shù)膠的攙假蜂膠，含有6號(hào)峰；而7號(hào)峰和11號(hào)峰的峰面積顯著降低，可以參照真品蜂膠和楊樹(shù)膠的指紋圖譜進(jìn)行判別。

各種蜂膠10個(gè)特征峰的相對(duì)峰面積RA(以蜂膠總峰面積為分母，樣品中各色譜峰面積為分子，計(jì)算得到)見(jiàn)表2。

表2  各種蜂膠7個(gè)特征峰的相對(duì)峰面積(RA/%)

    攙假蜂膠中，7號(hào)峰明顯低于8號(hào)和9號(hào)峰，提示含量不足；而6號(hào)峰呈現(xiàn)，提示攙有楊樹(shù)膠。

    3 討論

    黃酮類化合物為蜂膠的主要功效含有，其種類及相對(duì)含量分布對(duì)于蜂膠的鑒別具有重要意義。根據(jù)黃酮類化合物的提取、測(cè)定方法，本文建立了蜂膠的HPLC指紋圖譜，反映了蜂膠中黃酮類化合物的分布特征。通過(guò)比對(duì)真品蜂膠與楊樹(shù)膠的HPLC指紋圖譜，特別是6號(hào)、7號(hào)、11號(hào)特征蜂，可以明顯地將兩者區(qū)別開(kāi)來(lái)。

    中制劑指紋圖譜已廣泛應(yīng)用于中制劑質(zhì)量的控制和鑒別，并有多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)用于指導(dǎo)生產(chǎn)和加工。蜂膠HPLC指紋圖譜的建立和應(yīng)用能有效地制止楊樹(shù)膠的泛濫。為凈化蜂膠市場(chǎng)提供有力的檢測(cè)依據(jù)。本項(xiàng)研究還是初步的，更深入、全面的研究有待進(jìn)一步展開(kāi)。

                                                             資料來(lái)源：蜜蜂雜志2005年第8期